RNA疗法进展与展望

  RNA疗法是指使用基于RNA的分子来治疗或预防疾病。一般来说，RNA序列是操纵其靶分子表达或活性的关键。一旦确定了核酸结构和给药方法，就可以使用这些预先建立的方法在相对较短的时间内生产用于针对新靶标的RNA药物。

  正是这种优势使mRNA疗法成为对抗新冠肺炎的新型疫苗的最重要和最有效的手段之一。这些mRNA疫苗前所未有的有效性重新点燃了人们对基于RNA治疗的兴趣。基于几十年来在RNA治疗领域的长期研究积累的成果，目前针对各种疾病的RNA治疗药物正在迅速发展，这些疗法往往是其他传统药物无法治疗的疾病。

RNA历史进展

  无数的发现使RNA疗法成为治疗人类疾病不可或缺的技术(图1)。RNA首先被Crick在他的研究《分子生物学的中心法则》中描述为遗传信息流中的关键角色，后来被发现的mRNA所证实，这突显了这些分子在遗传信息翻译中作为关键信使的重要性。

图1. RNA的重大发现和治疗的关键进展时间表

  对RNA领域来说，早期的RNA学者并不相信RNA可以产生双螺旋结构。然而，在1956年，Rich和Davies发表了第一个核酸杂交反应，证明了RNA可以基于其碱基配对互补形成与DNA相似的构型。这一发现为1993年发现microRNAs(miRNAs)和1998年发现RNA干扰奠定了基础，其中RNA双链的产生是RNA沉默的关键步骤。第一次将碱基配对用于治疗目的是由Stephenson和Zamecnik在1978年描述的，其设计了一种针对劳斯肉瘤病毒35S RNA序列的反义寡核苷酸来抑制病毒复制。大约20年后，第一种使用反义寡核苷酸的药物被FDA批准治疗巨细胞病毒性视网膜炎。

  RNA剪接，即转录后连接外显子并从初始RNA转录本中移除内含子的步骤，于1977首次被描述，现在是一种众所周知的致病机制，剪接变异与各种人类疾病有关。使用传统的小分子药物几乎不可能修复或调节这些剪接缺陷，但可以使用基于RNA的药物，特别是反义寡核苷酸来完成。1993年的一项研究使用一组针对地中海贫血前基因剪接点和分支点的反义寡核苷酸来纠正其异常剪接，减轻症状。这项研究现在目前是几种难以治疗的神经疾病的新疗法开发的基石之一。

  与反义寡核苷酸药物发展的漫长历史相比，从发现小干扰RNA(siRNAs)到将这些分子用于药物的使用所需的时间相对较短。RNA干扰(RNAi)最早是在1998年的一篇开创性论文中被描述的，这篇论文证明了用正义和反义RNA混合处理秀丽线虫胚胎可以有效和特异地抑制靶向内源mRNAs。由于RNAi简单而又强效，很快被科学界采纳，并在很短的时间内得到广泛应用。2010年基于RNAi技术针对核糖核苷酸还原酶M2亚单位的siRNA第一次用于临床试验，用于治疗黑色素瘤患者。在这项试验之后，对几种基于siRNA的药物进行了各种疾病的评估。第一个用于遗传性甲状腺素转运蛋白相关淀粉样变性患者的siRNA药物于2018年获得批准。

  尽管1961年mRNA被确认为基因翻译的信使，但研究人员花了近30年的时间才建立起一种将这种分子用于治疗目的的方法。特别是，几十年前发现的几种与RNA相关的酶促进了目前基于mRNA的治疗方法的发展。20世纪60年代初，在对病毒(孟加拉病毒和脊髓灰质炎病毒)的一系列研究中首次发现了依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp；又称RNA复制酶)，在这些研究中，发现这些病毒对依赖DNA的RNA聚合酶对抑制剂放线菌素D不敏感。目前，RdRp被用作生产自扩增RNA疫苗的基本因子。另一种关键的酶，逆转录酶，也是首先在病毒中发现的，是大多数逆转录病毒生命周期中的关键酶。在生产实践中，研究人员利用这种酶来克隆互补的DNA模板，以促进所需mRNA的生产。

  通过引入外源mRNA来产生特定蛋白质的尝试始于20世纪90年代。1990年，Wolff和他的同事将几个报告基因的mRNAs直接注射到小鼠的骨骼肌中，并观察到这些组织中持续的基因表达。这后来导致了对mRNA转录本作为疫苗的评估。研究人员使用体外转录的方法合成了流感核蛋白的mRNAs，并将它们装到脂质体中。然后将它们注射到小鼠体内，结果显示在这些动物中诱导产生病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞。随后在 1995年研究人员设计了第一个用于治疗癌症的mRNA疫苗。表达人类癌胚抗原(CEA)的载体可以安全地注射到表达CEA的小鼠模型的肿瘤细胞中。然而，这些动物实验花了很长时间才产生足够的数据，使的这项技术进入人体临床试验。2008年，报告了在转移性黑色素瘤患者中使用mRNA疫苗进行临床试验的首次结果。该研究使用了编码肿瘤相关抗原的鱼精蛋白保护的mRNAs，结果表明，这些载体的传递诱导了疫苗导向的T细胞的增加。首个针对传染病的mRNA疫苗的临床试验于2013年进行(NCT02241135)，旨在评估一种新型狂犬病疫苗的疗效。这些临床实验表明了用mRNA疫苗治疗是可以产生针对病毒抗原的功能性抗体的，从而说明这项技术的原理是可行的。最近，首个针对传染性疾病 SARS-CoV-2的mRNA疫苗于2020年在世界大多数国家获得批准。mRNA疫苗获批不易，这是30多年的研究结果积累才使得mRNA用于疾病预防或治疗成为可能。

RNA疗法优势出众   

  众所周知，基于RNA的药物具有多种优势特性，使它们成为开发各种新的治疗策略的理想候选者。

靶向无法下药的靶标

  基于RNA的药物的最大优势之一是它们能够靶向细胞内的几乎任何遗传成分，其中许多被认为是无法使用其他药物治疗的，包括小分子和抗体(图2)。以前的研究表明，只有不到三分之一的人类蛋白质可以有效地被小分子靶向。由于许多蛋白质具有相似的结构，直接靶向单一的特定靶蛋白并非易事。此外，由于与细胞质的相互作用有限，膜整合蛋白更难使用小分子或抗体进行靶向。然而，由于基于RNA的药物可以阻止这些蛋白质的生物发生，它们可能更适合抑制它们的产生，从而提高治疗效果。

图2. RNA疗法可以针对不同的细胞分子

快速生产

  一般来说，生产新型小分子或抗体药物的开发过程需要数年时间。然而，一旦确定了RNA的化学结构和进入体内的途径，就可以快速设计和合成基于RNA的药物用于临床试验。例如，如果开发了一种基于siRNA的药物来治疗由特定器官中的基因过度表达引起的疾病，只需改变siRNA的序列就有可能治疗同一器官内的其他疾病。这就是为什么使用肝细胞特异性结合物的siRNA药物正在被广泛开发，作为各种肝脏代谢相关疾病的治疗剂。COVID-19大流行之所以能得到遏制并显着降低感染者疾病严重程度的原因之一是针对COVID-19的mRNA疫苗开发得十分迅速并被快速的投入使用。

长效性

  虽然天然RNA很容易被天然核酸酶降解，但当对其合成进行各种修饰时，RNA的稳定性大大增加。此外，当这些RNA被包裹在脂质体等载体中时，RNA在全身给药后有效地免受核酸酶的攻击，从而延长了它的寿命。最近开发的药物inclisiran就是基于RNA的药物的长效作用的例证。该药物是一种针对PCSK9的siRNA。Inlisiran的沉默效应仅在一次注射后就能持续六个多月，与效力在几天内减半的小分子药物相比，可以显著延长给药间隔，并减少毒性。

治疗罕见病

  制药公司往往不愿为非常罕见的疾病生产新药，因为潜在利润有限。然而，在基于RNA药物的情况下，一旦RNA的化学成分及其传递系统得到优化，开发这些药物的新变种用于新疾病的成本就会大大降低。其中一个重要的例子是最近开发的一种剪接调节反义RNA药物，该药物旨在治疗患有罕见遗传病的患者，这是使用其他技术所不可能做到的。由于开发反义RNA药物的相关技术已经成熟，因此由于减少了工艺和开发成本，开发这种前所未有的罕见病疗法已成为可能。

没有遗传毒性风险

  与DNA疗法相比，RNA疗法没有明显的遗传毒性作用。在基于DNA的疗法中，DNA分子通过病毒载体传递到细胞，这种载体有可能整合到基因组中并导致突变。当使用RNA时，这种潜在的风险可以避免。

RNA递送已逐渐成熟

  基于RNA的药物的递送仍然是RNA疗法的最大挑战之一。这些基于RNA的疗法的大多数递送方法可以分为添加靶向部分，将RNA包封到基于脂质的纳米颗粒中以及直接递送到靶器官而无需大量修饰（图3）。

图3. RNA疗法的三种主要给药方式

  在大多数GalNAc偶联的siRNA，如givosiran和inclisiran，GalNAc连接到siRNA的3ʹ末端，允许去唾液酸糖蛋白受体识别，这是一种主要与肝细胞相关的蛋白质，从而导致靶向递送到肝脏。这种方法效率的提高在很大程度上取代了以LNP为基础的小RNA药物向肝脏的输送。Alnylam公司开发了第一种用于治疗淀粉样变性的siRNA药物Patisiran，该公司设计这种药物刚开始使用基于LNP的给药方法，但现在正在测试新siRNA药物vutrisiran，被设计为使用基于GalNAc的给药，用于治疗同样的疾病。 虽然在使用mRNA疫苗时，靶向特定器官的需要相对较低，但当使用mRNA治疗酶缺乏时，向所需器官靶向递送是很重要的，因为mRNA主要运输到肝脏或肾脏，并在肝或肾中消除。这就是为什么目前许多基于RNA的疗法都集中在这些器官的疾病上。因此，未来在这一领域的工作应该侧重于将这些药物扩大到其他器官和细胞类型。 许多研究评估了当靶标适合时使用裸RNA直接递送的情况。这方面的一些例子包括通过鞘内注射的Nusinesen和通过玻璃体内注射的pegaptanib(图4)。在这两种情况下，这种给药方法都是可能的，因为它将这些药物限制在它们的目标器官，使它们不太可能被肝脏或肾脏过滤或消除。这些药物的成功表明，这种给药方式可能适用于治疗一些眼科和神经系统疾病。

图4. 已批准的基于RNA的疗法的不同给药途径

小结

  在过去的几年里，RNA技术促进了特别有效的mRNA疫苗的快速发展，从而突出了它们在对抗未来的病毒大流行和其他传染性疾病方面的效用。尽管RNA向靶器官的传递和有效地进入细胞仍然具有挑战性，但RNA药物的许多优点(包括针对广泛的遗传分子的潜力、快速高效的生产、长效性、对罕见疾病的有效性和降低遗传毒性的风险)使这些技术的开发成为一项值得的投资。受到包括新冠肺炎mRNA疫苗在内的新型RNA药物的启发，许多研究人员正在做出前所未有的努力来开发基于RNA的新药。因此，随着RNA治疗技术的进步，基于RNA的药物和给药方法有望得到更多样化的发展，RNA疗法已全面迈向快速发展的新时代。

参考文献

1.RNA therapy: rich history, various applications and unlimited future prospects.

2.RNA therapy: current status and future potential.

3.mRNA vaccine for cancer immunotherapy.

4.Drug delivery systems for RNA therapeutics.