【中西合璧】基于海马α7nAChR/NF-kB信号通路的耳迷走神经刺激在慢性不可预测温和应激模型老鼠的抗抑郁作用机制

上海中医药大学附属龙华 医院麻醉科

【摘要】背景：应激诱导的神经炎症被认为在抑郁症的发病机制中起关键作用。经皮耳迷走神经刺激(TAVNS)是治疗抑郁症患者的一种相对非侵入性的替代疗法。迷走神经的抗炎信号是由α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)介导的，而海马区是α7nAChR分布最多的区域，负责调节情绪。在这里，我们通过纯合子α7nAChR(α7nAChR，−/−)基因敲除和α7nAChR拮抗剂(甲基乌头碱，MLA)，研究了α7nAChR介导的海马神经炎症在TAVNS抗抑郁效应中的作用。

方法：随机分为对照组、模型组、TAVNS组、α7nAChR(−/−)+TAVNS组、海马(Hi)MLA+TAVNS组、海马生理盐水+TAVNS组。除对照组外，我们采用慢性不可预测性温和应激(CUMS)方法42天建立抑郁模型大鼠。造模成功后，除对照组和模型组，其余组大鼠均给予耳甲迷走神经电针刺激，频率2/15 Hz，电流2 mA，30min/d，持续21d。在基础状态、造模后和TAVNS干预后进行行为学测试，包括蔗糖偏好试验(SPT)、旷场试验(OFT)和强迫游泳试验(FST)。这些测试被广泛用于评估大鼠的抑郁样行为。实验结束后取材，检测α7nAChR、NF-KB p65、IL-1β的表达及小胶质细胞的形态。

结果：模型组大鼠抑郁行为和海马神经炎症表现为α7nAChR表达下调，NF-KB p65和IL-1β表达上调，小胶质细胞形态呈阿米巴样活化状态。电刺激可明显逆转上述现象，但对α7nAChR(−/−)大鼠和海马 MLA大鼠无明显改善作用。

结论：经皮耳迷走神经电刺激的抗抑郁作用与海马α7nAChR/NF-KB信号通路有关。

关键词：抑郁症，经皮耳迷走神经刺激，神经炎症，α7烟碱型乙酰胆碱受体，细胞因子

背景

重度抑郁障碍(MDD)是一种以情绪低落、快感缺乏、精力减退、思虑过多、认知障碍、植物性症状和试图自杀为特征的高度普遍的心理健康状况。流行病学研究表明，全世界抑郁症患者总数估计约为3.5亿，这是全球致残的主要原因，全球患病率为2.6-5.9%。根据全球预测，到2030年，MDD将成为所有健康状况负担的单一主要原因。尽管可用的药物治疗方法越来越多，但据估计，约有30%-60%的患者对现有治疗无效，并与胃肠道反应、肝脏毒性和其他副作用有关。而约40%的患者在停药后仍有症状，10年内抑郁症的复发率为85%。因此，开发包括生物电子医学在内的更有效的非药物治疗方案至关重要。

迷走神经是第十对脑神经，它主要是感觉神经，本质上是将生物反馈传递给大脑。2005年，美国食品和药物管理局批准迷走神经刺激(VNS)用于难治性MDD患者。值得注意的是，VNS产生全身性抗炎效应，这可能是其对抗抑郁药物无效的患者有效的一个重要原因。然而，VNS需要手术，并受到术后并发症的限制，如呼吸困难、咽炎等。神经解剖学研究表明，迷走神经在体表的唯一分支是迷走神经耳支(ABVN)，主要分布于外耳道和耳甲(耳甲艇和耳甲腔)，耳甲艇仅由迷走神经耳支供应。经皮耳迷走神经刺激(TAVNS)作为一种很有前途的电疗方法，已被用于抑郁症的治疗。临床研究表明，TAVNS能显著提高非手术抑郁症患者的汉密尔顿抑郁量表(HAMD)和抑郁自评量表评分，临床疗效与迷走神经刺激相似。TAVNS经常用于MDD的治疗，特别用于残留症状。我们团队以前的研究表明，TAVNS的抗抑郁作用是通过孤束核-边缘叶-脑的默认网络介导的，而海马区是边缘叶的重要组成部分，海马区的异常与抑郁的因果有关联。但其在大脑中的潜在分子机制尚未完全阐明。

大量证据表明，神经炎症与抑郁症之间存在密切联系，而以脑内炎症细胞因子过度产生为特征的应激性神经炎症是抑郁症的重要发病机制。临床前研究还表明，慢性应激可导致脑内天然免疫系统的激活，而炎性细胞因子(如IL-1β)的增加可导致动物的抑郁行为。因此，可以推断，抗炎治疗可能是一种有前途的新选择。

研究表明，迷走神经可以作为中枢神经系统(CNS)和免疫系统之间的桥梁，在调节炎症方面发挥重要作用。我们先前的研究结果表明，耳迷走神经刺激能显著改善慢性坐骨神经挤压损伤模型大鼠的抑郁样行为和疼痛强度，并减少血浆、下丘脑和海马区TNF-α的释放。此外，我们还发现，迷走神经切断后或注射α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)拮抗剂后，TAVNS不能抑制内毒素诱导的TNF-α和NF-KB p65，这表明TAVNS可以通过α7nAChR介导的胆碱能抗炎途径改善内毒素诱导的炎症反应。

α7nAChR是一种主要表达于中枢神经系统小胶质细胞的亲离子受体，被认为在广泛的精神和神经疾病中发挥作用，并被细胞危险信号激活，如NF-KB。TAVNS在脾、肠、脑和炎症之间的关系中起着重要作用。α7nAChR介导迷走神经抗炎信号，并参与调节小胶质细胞激活的中枢胆碱能通路。此外，海马区是α7nAChR调节CUMS大鼠应激行为或情绪反应的重要部位。因此，我们试图了解TAVNS是否可以改善暴露于CUMS的大鼠的行为缺陷和减少神经炎症，以及这种基于抗炎的抗抑郁药作用是否通过调节α7nAChR来实现的。具体地说，我们检测了包括快感缺失、探索和运动活动在内的时间点的行为，通过纯合子α7nAChR(−/−)基因敲除大鼠。检测了收集的海马区α7nAChR和相关的神经炎性标志物(小胶质细胞、NF-KB p65、磷酸化的NF-KB p65、IL-1β)。

方法

动物饲养

雄性SD大鼠，6周龄(200±20g，n=60)来自军事医学科学院实验动物中心(北京)，纯合子α7nAChR(−/−)基因敲除大鼠，6周龄(200±2 0g，n=10)来自赛业生物科技公司（广州）。所有大鼠被安置在20-25℃，湿度为55±2%的受控环境中，保持在12h/12h的光/暗循环下的安静状态，并自由获取食物和水(除非有指示)。所有操作均经中国医学科学院针灸研究所动物保护与使用委员会(许可证号：D2019-02-11-3)。此外，所有动物实验都遵循指南，并根据美国国立卫生研究院关于照顾和使用实验动物的指南进行。由于雌激素对应激的保护作用，本研究只选择雄性大鼠。暴露于CUMS的大鼠分别被安置在不同的笼子中进行社会隔离，对照组每笼5只。

实验设计：SD大鼠适应性饲养7d后，随机分为对照组、模型组、TAVNS组、海马MLA+TAVNS组和海马生理盐水+TAVNS组。α7nAChR(−/−)+TAVNS组、海马α7nAChR拮抗剂+TAVNS组、海马生理盐水+TAVNS组造模及干预方法相同，每组10只。造模期间除对照组外，其余各组均接受为期42天的社会隔离和CUMS训练。造模成功后，Hi MLA+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组在背侧海马区埋管。两组大鼠埋管后静息3d，在CUMS程序前1h,两组大鼠每次80μg/kgMLA或生理盐水，连续单侧局部滴注1周。TAVNS组、α7nAChR(−/−)+TAVNS组、Hi MLA+TAVNS组、Hi生理盐水+TAVNS组于术前1h给予TAVNS，每日1次，连续21d。在实验指南实施前，对所有大鼠进行蔗糖偏好试验(SPT)、旷场试验(OFT)和强迫游泳试验(FST)，以确保基线特征的一致性。详细的实验步骤如图1、图2所示。

CUMS模型准备

CUMS模型已被证实为啮齿动物抑郁症最相关的模型之一。在这项研究中，根据前面描述的方法对CUMS模型进行了修改，并进行了一些适当的调整以增强不可预测性。大鼠接受7种不同的应激源：夹尾巴3min，冷水游泳(4°，5min)，禁食24 h，关在湿笼子里(24 h，200ml水与100g木屑混合)，断水(24 H)，连续通宵光照(12 H)和电击脚(1 mA，每次10 s，间隔10 s，2℃)。其中一个应激源按照大鼠的随机顺序每天都会施行，每个应激源不会连续安排2天，以避免大鼠能预测到。

TAVNS的干预

在造模第21天，用SPT、OFT和FST观察CUMS大鼠造模是否成功。在造模成功的基础上，分别给予α7nAChR(−/−)+TAVNS组、海马MLA+TAVNS组、海马生理盐水+TAVNS组，连续21d。刺激使用电针仪(HANS200A，南京济生医疗科技有限公司)。干预过程中，大鼠用2%异氟醚吸入剂(河北九森药业有限公司)持续麻醉，将两个相对的磁极(±)和自制的金属耳夹板(长2 cm，宽0.5 cm，厚0.05 cm)合并，连接到耳甲形成一个电子圈(见图3)。刺激参数如下：1刺激频率：2/15 Hz(2和15 Hz，每秒切换)；2刺激强度：2 mA；3刺激持续时间：30min/d。

体重

本研究中，分别在造模前、造模后和干预后称量大鼠重量。体重是判断大鼠模型是否成功以及干预是否有效的重要指标，可用于模拟抑郁症患者的躯体症状，如食欲变化。

脑室注射

造模第21天，Hiα7nAChR拮抗剂+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组进行脑室灌注。20只大鼠吸入2%异氟烷(河北九山药业股份有限公司，河北，河北)，于背侧海马区置管。在头皮上做了一个纵向切开，然后露出了头骨。门齿杆经过调整，使（冠状位bregma和lambda都在背侧中线上，利于定位，详见脑立体定位）bregma和lambda在同一高度。海马背侧坐标位于bregma坐标后3.6 mm，外侧2.75 mm，垂直3.0 mm(根据Paxinos和Watson图谱)。三颗螺丝钉固定在头盖骨的置管的周围；用螺丝缠绕在螺丝钉上，帮助固定由头骨塑料粘固剂形成的保护帽，该保护帽被用来包围和固定置管的套管。术后给予大鼠3天的休息。套管(RWD有限公司，中国深圳)固定在聚乙烯管上，并连接到微注射器(50μl，哈密尔顿)。α7nAChR拮抗剂甲基乌头碱 (MLA，MedChemExpress Co.，Ltd.，中国)溶于无菌生理盐水(2 mg/ml，2.29 mM)中。参考并调整文献中的MLA剂量，输注程序设定为以1ul /min，并由微型注射器泵输送。MLA每次80μg/kg，连续单侧局部滴注1周。每次输液后，将注射器套管留在导管处10min。对照组注入等量无菌生理盐水。海马生理盐水组注入相同程序、相同体积的无菌生理盐水。

行为学实验

糖水偏好实验

如前所述，分别在造模前、造模后和干预后进行行为学实验蔗糖偏好测试(SPT)。快感缺乏被认为是抑郁症的核心症状之一，本研究采用SPT对大鼠的快感缺失行为状况进行了评估。训练大鼠在适应周期中适应1%蔗糖溶液(AMRESC0335，美国)。所有大鼠在适应后禁食、断水23h，然后关在单独的笼子里，自由进入两个预称量的瓶子，瓶子里装有240ml蔗糖溶液(1%w/v)和240ml纯水1h，实验结束时，称1%蔗糖溶液和纯净水的瓶子并记录下来。蔗糖偏好百分比的差异由以下公式计算：蔗糖偏好比率(%)=蔗糖消耗量/(蔗糖消耗量+纯净水消耗量)×100%。

旷场实验

分别在造模前、造模后和干预后进行大鼠旷场运动试验(OFT)，这是常用的测量啮齿动物一般活动和探索意愿的方法。使用的器材是一块100厘米×100厘米×40厘米的塑料板制成的正方形场地，四壁和底面均为黑色，底面用白色条纹分成20厘米×20厘米的等距方格。当大鼠被轻轻放置在广场中央时，允许它们自主运动和自由探索，同时我们监测并记录3min内的水平运动(至少三只爪子进入同一正方形，计1分)和垂直运动(大鼠后腿直立，计1分)的得分。每只大鼠测试后用75%乙醇清洗OFT装置，以避免这只大鼠留下的气味信号对下一只大鼠的干扰。整个实验过程由仪器上方约120厘米的摄像机记录下来。

强迫游泳实验(FST)

在本研究中，分别在造模前、造模后和干预后对大鼠进行强迫游泳实验，这是评估啮齿动物行为绝望程度的常用方法。实验前，将大鼠分别放入强迫游泳水桶(白色塑料圆柱体，高60 cm，直径30 cm，水深45 cm)。实验前一天，大鼠在24~26℃的水中游泳15min，然后开始适应环境。实验当天，每只大鼠游泳5min，桶上方架设摄像机，清晰观察记录大鼠不动时间。除去强迫游泳前后1分钟，计算3分钟不动时间。当老鼠不再挣扎或只是漂浮在水中时，不动的定义是不游泳，不包括细微的肢体运动以保持呼吸。

Western印迹分析

实验结束后，用戊巴比妥钠(35 mg/kg，ip)麻醉大鼠。然后断头取脑。冰上分离海马。用预冷的无菌生理盐水清洗后，将海马体标本保存在预冷的1.5ml低温微管中，并在液氮中进行快速冷冻。然后将样品放入-80°C的冰柜中进行进一步的实验程序。样品在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中匀浆，用于蛋白质提取。然后收集上清液，在13,000转/分，4℃下离心20分钟。蛋白浓度测定采用比辛酸(BCA)法。用5%、12%和15%的十二烷基硫酸钠凝胶分离等量的蛋白质样品，然后转移到聚偏氟乙烯膜(0.2或0.45μm)。用5%牛血清白蛋白、Tris缓冲盐水加Tween(BSA-TBST)在室温(RT)下封闭膜1h，并在4°与以下主要抗体孵育过夜：抗NF-KBp65(1：1000，兔单抗，CST/8242)、抗磷酸化NF-KB P65(1：500，兔单抗，Cst/3033)、抗IL-1β(1：500，兔多抗，Abcam/ab9722)、抗α7nAChR(1：500，兔多克隆，Abcam/ab10096)。用抗β-肌动蛋白(1：3000，鼠单抗，AbCaM/ab6276)证实了相等的上样量。墨迹在TBST中洗涤5次后，二抗(1：5000、各自地、山羊抗鼠抗体(Abcam/ab6789)、山羊抗兔抗体(Abcam/ab6721)在常温下孵育1h。该信号在ImageQuant LAS4000迷你图像分析仪(GE Healthcare，英国白金汉郡)上捕获，并使用Quantity One软件v.4.6.2(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)对波段水平进行量化。

免疫荧光染色分析

大鼠(每组3只)先用生理盐水灌胃，再用4%多聚甲醛溶液灌胃。取脑组织，浸泡在25%蔗糖溶液中(0.1M PBS为溶剂)，直至组织沉入试管底部。将每个样品切成30μm厚的切片(Microm International FSE，Thermo，USA)。自由漂浮切片在0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)中孵育，用PBS Tween-20(PBST)洗涤3次，然后用5%正常驴血清在0.01M PBST中常温封闭30min。为了观察α7nAChR、IL-1β和离子钙接头蛋白抗体 (Iba-1)的共表达，将切片分别与抗Iba-1(山羊多克隆，1：200，Abcam/ab5076)、抗α7nAChR(兔多克隆，1：50，Abcam/ab10096)和抗IL-1β(兔多克隆，1：50，Abcam/ab9722)在4℃下孵育过夜。PBS洗涤后，将切片置于含有Alexa Fluor®488标记的驴抗兔抗体(1：300，Abcam/ab150073)和Cy3®预吸附的驴抗山羊抗体(1：300，Abcam/ab6949)的溶液中常温下孵育2h，将组织固定在含有DAPI(Genepool/GPB18242)的贴壁介质中。这些图像是用奥林巴斯FV9100系统拍摄的。

统计分析

采用SPSS26.0软件包(IBM，Armonk，New York，NY，USA)进行统计分析。体重、行为测试和蛋白质印迹实验均以均数±标准差表示，重复测量采用单因素方差分析。一旦F比率显著，post hoc检验将由Tukey post hoc 检验进行比较。个体均数之间的差异按Fisher最小显著差异法进行检验，P<0.05被认为具有统计学意义。

结果

体重和行为学实验

体重

在基线(-21d)时的体重，组间体重差异无统计学意义(P>0.0 5)。第0天，模型组、TAVNS组、α7nAChR(−/−)+TAVNS组大鼠体重均显著低于对照组(P<0.01,P<0.001，P<0.001)。21d时，与模型组比较，TAVNS组大鼠体重显著增加(P<0.001)。α7nAChR(−/−)+TAVNS组与TAVNS组相比，体重明显减轻(P<0.001)(如图4a1所示)。基线(−21d)时，各组间体重差异无统计学意义(P>0.05)。造模21d后，Hi MLA+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组大鼠体重均显著低于对照组(P<0.001，P<0.0 1)。第25天，Hi MLA+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组大鼠体重均显著低于对照组(P<0.01，P<0.01)(如图5a2所示)。

蔗糖偏好实验的变化

实验前，各组大鼠对蔗糖的偏好差异无统计学意义(P>0.05)。当在不同时间点实施CUMS或TAVNS时，各组大鼠的蔗糖偏好均发生显著变化。与对照组相比，其余3组大鼠在第0d的蔗糖偏好显著降低(P<0.001)。在TAVNS干预后，这一结果发生了逆转。与模型组比较，21天时大鼠对蔗糖的偏爱程度显著升高(P<0.001)。α7nAChR(−/−)+TAVNS组大鼠的蔗糖偏好较TAVNS组降低(P<0.001)。

在基线(−21d)，各组大鼠对蔗糖的偏好无显著差异(P>0.0 5)。造模21d后，Hi MLA+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组大鼠的蔗糖偏好显著低于对照组(P<0.01，P<0.01)。第25天，与Hi生理盐水+TAVNS组相比，Hi MLA+TAVNS组的蔗糖偏好显著降低(P<0.05)(如图5b2所示)。

OFT水平运动和垂直运动分数的变化

在基线−21天，各组间水平运动和垂直运动评分差异均无统计学意义(P>0.05)。如图所示。4c1，d1，与对照组相比，第0d，其他3组大鼠水平运动和垂直运动评分均显著降低(P<0.001)。有趣的是，TAVNS的干预逆转了这一趋势。与模型组比较，TAVNS组大鼠第21天水平运动和垂直运动评分均显著增加(P<0.001，P<0.0 1)。然而，α7nAChR(−/−)+TAVNS组水平运动分值显著减少(P<0.0 5)。在基线(−21d)时，各组间水平运动和垂直运动评分差异无统计学意义(P>0.0 5)。造模21d后，Hi MLA+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组大鼠的水平运动评分和垂直运动评分均显著低于对照组(水平运动得分P<0.01,P<0.01;垂直运动得分P<0.01， P<0.001)。第25天，与Hi生理盐水+TAVNS组相比，Hi MLA+TAVNS组水平运动评分显著降低(P<0.05)(如图5c3、d4所示)。

强迫游泳实验不动时间的变化

−2 1d各组间FST不动时间差异无统计学意义(P>0.0 5)。造模后(0天)，对照组大鼠不动时间明显长于其他3组(P<0.05)，FST显示模型组、α7nAChR(−/−)+TAVNS组大鼠表现出抑郁样行为。经TAVNS干预21d后，与模型组比较，TAVNS组大鼠不动时间明显缩短(P<0.01)。α7nAChR(−/−)+TAVNS组与TAVNS组比较，不动时间明显呈上升趋势，但无统计学差异(P>0.05)(如图4e1所示)。在基线(−21d)时，各组间不动时间差异无统计学意义(P>0.0 5)。造模后第0d，Hi MLA+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组大鼠不动时间显著高于对照组(P<0.01，P<0.01)。第25天，Hi MLA+TAVNS组与Hi生理盐水+TAVNS组比较，不动时间显著延长(P<0.01)(如图5e2所示)。

免疫印迹分析

α7nAChR在海马区的表达

α7nAChR在各组间的表达差异有统计学意义。模型组α7nAChR表达明显低于对照组(P<0.0 5)。与模型组比较，TAVNS组α7nAChR表达增强(P<0.0 1)。α7nAChR(α7nAChR(−/−)+TAVNS)组由于α7nAChR基因被敲除，其蛋白不表达(图6A)。

海马区IL-1β的表达

与对照组比较，模型组大鼠海马区IL-1β的表达明显上调(P<0.001)。值得注意的是，与模型组比较，TAVNS能显著降低模型组大鼠海马区IL-1β的表达(P<0.001)。而IL-1β在α7nAChR(−/−)+TAVNS组的表达明显高于TAVNS组(P<0.0 5) (Fig. 6b)。

NF-kB p65和磷酸化NF-kB p65在海马区的表达

模型组与对照组比较，NF -kB p65和磷酸化NF-kB p65的表达显著增加(P<0.001)。与模型组比较，TAVNS能逆转模型组大鼠海马神经元NF-kB p65和磷酸化NF-kB p65的表达，差异有统计学意义(P<0.001，P<0.01)。不过与TAVNS组相比，α7nAChR(−/−)+TAVNS组的NF-KB p65和p-NF-kB p65的表达明显增加(P<0.0 1)。

免疫荧光染色观察TAVNS对大鼠海马小胶质细胞和α7nAChR表达的影响

本研究采用小胶质细胞Iba-1免疫荧光染色方法，观察各组大鼠海马区小胶质细胞的形态，以确定小胶质细胞的静息或激活状态。对照组小胶质细胞细小，提示处于静息状态。与对照组相比，模型组小胶质细胞激活，胞体不规则增大。与模型组比较，TAVNS组小胶质细胞形态未见明显激活。α7nAChR(−/−)+TAVNS组和Hi MLA+TAVNS组小胶质细胞与Hi生理盐水 + TAVNS组相比,形态呈阿米巴样激活，胞体较大，突起较短。对照组和TAVNS组α7nAChR主要表达在小胶质细胞膜上，而对照组和TAVNS组α7nAChR与小胶质细胞的共表达均高于模型组。与α7nAChR(−/−)+TAVNS组和Hi MLA+TAVNS组相比，Hi生理盐水+TAVNS组α7nAChR与小胶质细胞共表达增加(图7、8)。

TAVNS对大鼠海马区小胶质细胞及IL-1β表达的影响

IL-1β在对照组有少量表达或无表达。促炎细胞因子IL-1β与小胶质细胞共表达在模型组显著增加，而在TAVNS组则相反。与α7nAChR(−/−)+TAVNS组和Hi MLA+TAVNS组相比较，海马生理盐水+TAVNS组促炎细胞因子IL-1β与小胶质细胞共表达减少。各组小胶质细胞的形态变化与前面描述的一致(图9、10)。

激活或静息状态的小胶质细胞数

与对照组相比，模型组激活的小胶质细胞数显著增加(P<0.01)。静息状态下模型组小胶质细胞数量较TAVNS组增多(P<0.001)。α7nAChR(−/−)+TAVNS组静息小胶质细胞数较TAVNS组明显减少(P<0.01)。HI 生理盐水+TAVNS组激活的小胶质细胞数较HI MLA+TAVNS组减少(P<0.01)(图11)。

讨论

虽然抑郁症的发病机制尚不清楚，但大量研究表明，应激引起的神经炎症与抑郁症密切相关抗炎治疗已成为抗抑郁的新选择，最近的荟萃分析支持这一概念。先前的研究表明，TAVNS可以有效治疗抑郁症。根据迷走神经与免疫系统的关系，我们推测，神经炎症的调节可能在TAVNS的抗抑郁作用中发挥重要作用。然而，由于缺乏证据和方法的异质性，这一猜想仍然存在争议。因此，在本研究中，我们通过CUMS方法建立大鼠抑郁模型，该模型已证明与抑郁症的症状是相似的，并准确地概括了人类的状况。我们试图在分子水平上为TAVNS的抗抑郁作用提供一些令人信服的发现，并为探索抑郁症的新治疗方法提供一个新的框架。

生活中慢性和长期的应激性事件是导致人群抑郁的主要原因。CUMS被认为是建立抑郁症大鼠模型的最有效和最可靠的方法之一，在建模周期中通常持续21天以上。这种方法模拟了抑郁症的各种压力源。暴露于CUMS的动物将表现出一系列类似抑郁的行为，如行为绝望、快感缺失、更少的探索和更少的运动。评估这种行为的方法包括OFT、SPT和FST。在这项研究中，我们使用上述三种行为方法评估了CUMS模型大鼠的抑郁样行为。我们得出结论，TAVNS可以缓解CUMS诱导的大鼠抑郁样行为，这在一定程度上与我们之前的临床研究一致。结果发现，CUMS显著降低旷场实验大鼠的探索和运动能力，减少大鼠强迫游泳实验的不动时间和糖水偏好百分率。相比之下，α7nAChR(−/−)大鼠的实验结果在干预后并没有改善。因此，我们推测α7nAChR是TAVNS发挥中枢抗抑郁作用的靶点。

α7nAChR在调节炎症中小胶质细胞功能的中枢抗炎过程中发挥重要作用，并广泛分布于中枢神经系统,不仅在神经元中，而且在神经胶质细胞中也是如此。海马体是参与认知和情绪调节的关键核团，有许多α7nAChR亚单位的表达。表达最高的受体是α7nAChR。作用于α7nAChR可以调节海马区突触的可塑性。小胶质细胞异常与多种脑部疾病有关，包括抑郁症。小胶质细胞在受到各种刺激后表现出广泛的激活状态，并可分为分泌促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α、IL-1β、IL-6的M1表型和产生抗炎因子如IL-4和IL-10的M2表型。众所周知，迷走神经具有积极的抗炎作用，通过激活α7nAChR来调节免疫细胞的功能。

α7nAChR是介导迷走神经炎症反射的关键受体。TAVNS刺激迷走神经耳支，大脑从迷走神经传入纤维接收信息。传入纤维投射到脑干的孤束核(NTS)和蓝斑(LC)，然后形成从NTS到下丘脑、杏仁核、海马体、额叶和大脑其他区域的直接和间接上行投射。此外，α-7nAChR还可影响巨噬细胞、小胶质细胞和神经元的胆碱能抗炎作用。我们的研究还阐明了在TAVNS 干预21天后小胶质细胞的形态从阿米巴样激活状态转变为静息状态，胞体较小，突起细长，自由伸展，M1表型分泌的IL-1β水平下降。而α7nAChR(−/−)组大鼠小胶质细胞形态以阿米巴样活化为主，其海马区IL-1β含量高于TAVNS组。在本实验中，我们使用了一种特异性的α7nAChR拮抗剂甲基乌头碱，并将其注入背侧海马区，以探讨α7nAChR在海马区的作用。结果表明，与Hi生理盐水+TAVNS组相比，TAVNS对Hi MLA+TAVNS组大鼠的抑郁样行为无明显逆转作用。α7nAChR介导的烟碱具有抗炎活性，其机制涉及抑制NF-KB信号转导。结合观察，表明负责这一反应的受体是α7nAChR亚型。静息状态的小胶质细胞没有表现出炎症信号通路的激活，这反映在KB抑制物(IKB)与胞浆内的NF-KB p65和p50亚单位的结合。这意味着NF-KB信号通路仍然处于失活状态。然而，在过度应激的情况下，IKB被磷酸化并暴露于蛋白质降解环境中。在此之后，IKB蛋白的降解使NF-KB从失活状态变为活性状态，而激活的NF-KB导致了核转位。NF-KB p65发生核转位，调节促炎症细胞因子，如IL-1β。

NF-KB信号是应激的抗神经源性和行为学行为的重要介体。NF-KB与神经炎症密切相关。一方面，作为一种多效调节因子，NF-KB参与了炎症介质的调节和炎性细胞因子的转录和表达；另一方面，IL-1β等炎症因子可以激活NF-KB，这一循环加剧了炎症反应。实验表明，应激抑制海马区的神经发生已被证明是应激的前抑郁效应，可被NF-KB的一种抑制剂阻断。我们的研究还观察到，造模后IL-1β和NF-KB p65的含量增加，但这种现象被TAVNS缓解。但IL-1β、NF-KB p65和p-NF-KB p65在α7nAChR(−/−)大鼠仍处于高水平，即使在TAVNS干预后也是如此。此外，α7nAChR的激活阻断了内毒素介导的NF-KB核转位，这表明所观察到的抗炎作用可能是通过抑制NF-KB途径而介导的。α7nAChR/NF-KB信号通路是调节中枢神经系统炎症的重要途径，本实验结果提示，TAVNS可上调小胶质细胞表达α7nAChR。α7nAChR可抑制NF-KB核转位和磷酸化p65的表达，从而减少IL-1β的含量。因此，TAVNS的抗抑郁作用与海马α7nAChR/NF-KB信号通路有关(图12)。

结论

本研究表明TAVNS缓解CUMS大鼠的抑郁行为与α7nAChR介导的海马神经炎性反应有关。重要的是，我们的结果表明，TAVNS干预可以有效地缓解CUMS模型大鼠的抑郁样行为。这种抗抑郁作用是通过上调α7nAChR来抗炎的，它阻止了NF-KB的核转位及其磷酸化的p65的表达，从而减少了促炎细胞因子的产生，如IL-1β。因此，TAVNS的抗抑郁作用可能与调节α7nAChR/NF-KB信号通路有关。希望本研究能为从抗炎的角度探索神经调节技术为治疗抑郁症提供新的思路。

中西合璧述评

中枢神经系统炎症是导致术后认知功能下降，术后抑郁等多种疾病的原因之一，因此理论上减轻中枢神经系统炎症可以降低抑郁评分。常用的降低中枢神经系统炎症的方法，包括糖皮质激素、非甾体类抗炎药、炎性细胞因子拮抗剂及氯胺酮等一些麻醉药物。但是这些所有的药物均具有不同程度的副作用和使用禁忌，能否有一种基本上无副作用和禁忌的方法，一直是临床追求的技术。有研究发现电刺激迷走神经的可以抑制炎性的发生，传统的方法是在颈部分离出迷走神经，手术会造成一定的创伤。后又有学者发现，在耳部的耳甲区和外耳道是唯一在体表分布的迷走神经分布区，因此刺激此区域可以激活迷走神经。恰巧中医发现此部位刚好就是内脏的穴位分布区域，具有调节内脏功能的作用。因此经耳穴迷走神经电刺激就成了刺激迷走神经最优途径。但是其作用机制一直不清，因此探讨其作用机制是近年来的热点。

此研究也存在一些局限性，其机制尚需要深入探讨。比如结论只是发现α7nAChR参与了此过程，而α7nAChR如何被激活，以及激活后通过什么途径抑制了IL-1β、NF-KB p65的表达，都有待于进一步阐明。

译稿：罗青

述评：彭生

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