黄体酮对雄性切口痛大鼠机械缩足反射阈值、脊髓神经激肽‑1受体及血浆P物质表达的影响

苏凯1 缪慧慧2 田鸣1 薛富善1

1首都医科大学附属北京友谊医院麻醉科，北京 100050；2首都医科大学附属北京世纪坛医院麻醉科，北京100038

国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(03):231-234.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210917‑00493

 基金项目 

北京市自然科学基金（7214221）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究拟通过观察黄体酮及其拮抗剂米非司酮对雄性切口痛大鼠机械缩足反射阈值（PMWT）、脊髓神经激肽‑1受体（NK‑1R）、血浆P物质表达水平的影响，探讨黄体酮对疼痛影响的可能机制。

1 材料与方法      

1.1　实验动物及分组

SPF级健康成年雄性Wistar大鼠24只，采用随机数字表法分为3组（每组8只）：对照组（C组）、黄体酮组（P组）、米非司酮组（M组）。C组吸入七氟醚麻醉并手术；P 组麻醉手术前3 h黄体酮1.5 mg/100 g前肢肌内注射；M 组麻醉手术前3 h 米非司酮1.5 mg/100 g灌胃。

1.2　试 剂

黄体酮注射液20 g/L；米非司酮25 mg/片，溶于食用色拉油，质量浓度为2 g/L；大鼠NK‑1R抗体；大鼠P物质ELISA试剂盒。

1.3　方 法

1.3.1　疼痛模型制备

大鼠吸入七氟醚麻醉后，使用碘伏棉球消毒大鼠左侧后爪，采用Brennan 法从足底近端0.5 cm 处向趾部做1 cm长的条状切口，切开皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割，保持肌肉的起止及附着完整。按压止血后，用细线缝合皮肤2针即形成切口痛模型，整个手术过程持续5 min。

1.3.2　PMWT的测定

使用von Frey纤维丝以不同力度刺激大鼠足底切口近端内侧（距离手术切口不小于5 mm），刺激模式为纤维丝弯曲90°，持续时间为3 s，当大鼠出现迅速缩回、后足抬起、快速甩足、甩足后舔足、嘶叫等反应时计为阳性，记录此时刺激力度。初始刺激力度为6 g，若大鼠缩足反应为阳性则选用低一级的刺激力度；反之则选用高一级的刺激力度，测定3次，每次间隔5 min，均值即为PMWT。鼠后足最大压力设为60 g。所有过程均要求在安静、温和、避光的环境中进行。分别于给药前（T0）、手术前（T1）、手术后1 h（T2）、手术后3 h（T3）4个时间点测定大鼠术侧足PMWT。

1.3.3　腔静脉采血

大鼠于T3时间点测定PMWT后用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉，待大鼠处于深度麻醉状态下打开胸腔及腹腔，充分暴露腔静脉进行采血，使用乙二胺四乙酸抗凝采血管收集血液后3 000 g 离心10 min，取上清置微型离心管中−80 ℃冰箱保存。

1.3.4　ELISA法测定血浆P物质水平

按试剂盒说明书进行操作。

1.3.5　脊髓标本取材及NK‑1R水平测定

待大鼠腔静脉取血完毕后，经左心室将灌注导管置入主动脉，使用4 ℃ PBS对大鼠进行灌注，随后立即将大鼠置于冰上，快速剪开背部皮肤，分离肌肉及韧带，用器械咬断棘突及椎板，暴露脊髓L4~6节段，切断并取出后立即放入冻存管，投入液氮迅速冷冻后−80 ℃冰箱保存。

脊髓节段放入匀浆管，加入0.5 ml裂解液（包含1 mmol/L 酶抑制剂，1 mmol/L Na3VO4），使用电动匀浆器进行匀浆，整个匀浆过程在冰上进行，匀浆完成后使用超声对匀浆可见的组织颗粒进行粉碎，4 ℃ 16 000 g 离心15 min。采用DC蛋白检测溶液测定蛋白浓度。根据蛋白浓度使用上样缓冲液稀释至相同浓度，煮沸5 min后得到蛋白样品，上样后进行电泳，湿转法转膜；5%胎牛血清封闭，一抗（1∶1 000）4 ℃摇床孵育过夜；次日TBST缓冲液洗涤3次，10 min/次。二抗（辣根过氧化物酶标记，1∶3 000）室温孵育1 h，TBST洗涤3次，10 min/次；ECL显影液显影，采用Odyssey成像系统采集图像，使用Image J软件对条带进行定量分析。 

2 结 果      

2.1　3组大鼠不同时间点PMWT的比较

C组、P组和M组在T0（F=1.60，P=0.225）和T1（F=0.31，P=0.735）时间点，组间比较差异无统计学意义。T2（F=14.69，P<0.001）和T3（F=28.62，P<0.001）时间点，组间比较差异有统计学意义。T2和T3时间点，P组和M组PMWT高于C组［T2：（t=−5.42，P<0.001），（t=2.61，P=0.016）；T3：（t=7.49，P<0.001），（t=2.80，P=0.011）］，且P组高于M组（T2：t=2.81，P=0.011；T3：t=4.68，P<0.001）。见表1。

2.2　3组大鼠脊髓NK‑1R表达水平的比较

3组大鼠T3时脊髓L4~6节段NK‑1R表达水平，组间比较差异有统计学意义（F=76.01，P<0.001）。P组和M组NK‑1R表达水平低于C组（t=−12.32，P<0.001；t=−6.64，P<0.001），且P组低于M组（t=−5.68，P<0.001）。见图1。

2.3　3组大鼠血浆P物质水平的比较

3组大鼠T3时血浆P物质水平，组间比较差异有统计学意义（F=28.16，P<0.001）。P组和M组血浆P物质水平低于C组（t=−7.42，P<0.001；t=−4.71，P<0.001），且P组低于M组（t=−2.71，P=0.013）。见图1。

3 讨 论     

本研究结果显示，切口痛模型能够导致大鼠PMWT减低，同时黄体酮及其受体水平拮抗剂（米非司酮）预处理能够提升切口痛大鼠的PMWT，并且黄体酮对PMWT的提升作用要强于米非司酮。黄体酮和米非司酮均能够抑制脊髓NK‑1R受体的表达，且黄体酮对脊髓NK‑1R受体表达的抑制作用强于米非司酮。此外，黄体酮和米非司酮均能够降低血浆P物质水平，说明黄体酮受体可能参与P物质的表达和（或）释放。据此我们推测黄体酮受体与配体的结合状态可能抑制P物质的表达和（或）释放。黄体酮具有类固醇激素的特点，即对于真核基因表达既有正性调控（促使转录）作用，又有负性调控作用。由此推测血浆中P物质水平下降及脊髓NK‑1R下调可能是由于黄体酮受体的结合状态对相应基因的转录有直接抑制作用，或者是激活了转录抑制因子，从而导致血浆中P物质水平下降及脊髓NK‑1R水平下调，进一步减少相应炎症因子的释放，减轻疼痛和炎性反应。

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