glpK基因多样性及其对牛分枝杆菌药物敏感性的影响

Diversity of glpK Gene and Its Effect on Drug Sensitivity in Mycobacterium bovis 

Dong Y，Ou X， Liu C，Fan W，Zhao Y，Zhou X.

Infect Drug Resist，2022 ，15：1467-1475.

doi: 10.2147/IDR.S346724.

PMID: 35401008

      近日，《感染与药物耐药》（Infection and Drug Resistance）杂志发表了中国农业大学、中国疾控中心和中国动物卫生与流行病学中心合作开展的glpK基因多样性及其对牛分枝杆菌药物敏感性的影响研究（Diversity of glpK gene and its effect on drug sensitivity in Mycobacterium bovis. Infection and Drug Resistance, 2022, https://doi.org/ 10.2147/IDR.S346724）。作者研究发现，甘油激酶（glpK）基因突变可导致牛分枝杆菌生长减慢和对抗结核药物的敏感性降低，这可能导致耐药牛分枝杆菌的出现，由于牛分枝杆菌属于人畜共患致病菌，耐药牛分枝杆菌会对人类健康构成威胁。中国农业大学动物医学院的董玉慧为文章的第一作者，周向梅教授为论文的通讯作者。

背景

      结核分枝杆菌复合群是一组在遗传上密切相关但表型多样的生物体，与结核分枝杆菌不同，牛分枝杆菌体外培养时，不能利用甘油作为其唯一的碳源。牛分枝杆菌主要感染牛，但也可以感染包括人类在内的多种物种。牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的基因组相似度达到99.95%以上，由牛分枝杆菌引起的人类疾病症状与结核分枝杆菌引起的疾病症状相似。牛分枝杆菌引起的疾病的治疗通常包括利福平、异烟肼和乙胺丁醇，由于排除了吡嗪酰胺（牛分枝杆菌菌株对其天然耐药），治疗时间一般延长至9个月。国外也有由耐多药牛分枝杆菌引起感染的相关报道，包括散发病例和暴发疫情。

      根据世界卫生组织《2020 年全球结核病报告》，2019 年全球估算有 140 000 例由牛分枝杆菌引起的人畜共患结核病患者。使用抑制牛分枝杆菌生长的含甘油培养基导致人类被牛分枝杆菌感染的病例数量被低估和未报告。GlpK 基因中编码甘油激酶的移码突变体导致甘油分解代谢缺陷。越来越多的证据表明，glpK 基因中 7个胞嘧啶 (7C) 的均聚束 (HT) 中的移码突变可导致结核分枝杆菌的药物耐受。

      作者通过分析牛分枝杆菌临床分离株中的 glpK 移码突变，发现牛分枝杆菌中glpK 基因的 7C HT 中的多基因突变模式，并不是所有的移码突变都会导致甘油激酶失活。甘油对部分牛分枝杆菌的生长有促进作用。破坏甘油激酶活性的移码突变导致牛结核病中抗生素敏感性的广泛降低。

材料和方法

      60株临床牛分枝杆菌菌株来自中国疾控中心和中国动物卫生与流行病学中心前期课题合作分离培养菌株，并经鉴定为牛分枝杆菌。药敏试验采用微量稀释法，使用TREK Sensititre ® MYCOTBI药敏板（美国Thermo公司）对14种抗结核药物的耐药性进行测定，包括贝达喹啉、阿米卡星、乙胺丁醇、异烟肼、左氧氟沙星、莫西沙星、德拉马尼、利奈唑胺、氯法齐明、利福平、利福布丁、对氨基水杨酸、乙硫异烟胺和卡那霉素。提取牛分枝杆菌基因组DNA，进行全基因组测序，与标准株M. bovis AF2122/97进行序列比对，对glpK基因突变情况进行统计。提取牛分枝杆菌总RNA，经逆转录后，使用荧光定量PCR检测narX、narK2、dosR、hspX和frdA 基因表达量。

结果

一、临床牛分枝杆菌glpK基因存在多种突变模式

      当甘油作为唯一碳源时，牛分枝杆菌和结核分枝杆菌体外培养的主要区别是需要额外添加丙酮酸钠。M. bovis AF2122/97 在 glpK 7C HT 中的一个 C 插入，造成移码突变并导致编码序列截短。值得注意的是，在 BCG 中， glpK 8C HT 中的 2 bp 插入纠正了移码并导致glpK 增加了额外的密码子（表 1）。这种额外的密码子在所有测试的BCG 菌株（巴斯德、东京、丹麦、俄罗斯、Tice、Frappier、瑞典）均存在，这些菌株能在甘油培养基中生长。进一步分析显示，M. microti OV254 在glpK 中具有与 M. bovis AF2122/97 相同的移码突变（表1）。M. microti 与牛分枝杆菌一样，需要在甘油培养基中额外添加丙酮酸钠才能生长。

      为探究 glpK 基因多样性，我们对 60株牛分枝杆菌临床分离株进行了全基因组测序，并根据 glpK 7C HT 进行分组（表 2）。GlpK 移码突变在牛分枝杆菌中很常见。40.00% 的临床牛分枝杆菌由于 glpK 7C HT 中的单个 C 插入而导致甘油激酶失活。此外，我们检测到 26.67% 的临床分离株为 glpK 7C HT，与 M. tuberculosis H37Rv 相同。我们还检测到 26.67% 的 glpK 9C HT 分离株和 3.33% 的 glpK 10C HT 和 glpK 11C HT 分离株。

      通过分析 GMTV 数据库中 2819 株结核分枝杆菌菌株的基因组信息，我们发现 glpK 7C HT 中的移码突变也存在于结核分枝杆菌中，但频率低于牛分枝杆菌（表 3）。

二、甘油分解代谢变异可影响牛分枝杆菌的生长

      GlpK 基因编码一种参与甘油代谢的酶，前期研究表明，向结核分枝杆菌添加甘油可强烈促进细菌生长。我们监测了不同牛分枝杆菌glpK HT菌株的生长曲线。与 M. tuberculosis H37Rv 类似，与丙酮酸钠培养基相比，在甘油培养基中 M. bovis glpK 7C HT 菌株的生长得到促进（图 1A）。相比之下，代表大多数牛分枝杆菌的M. bovis glpK 8C HT 菌株在甘油培养基中生长缓慢（图 1B）。此外，M. bovis glpK 10C HT 菌株也能很好地利用甘油，这可能是因为这种突变只插入了一个额外的密码子并且不会导致广泛的密码子错配（图 1C）。

      为进一步验证M. bovis glpK 10C HT菌株的甘油利用能力，作者观察比较了其在以甘油或丙酮酸钠为碳源的固体培养基中的生长。在培养的第 12 天，在含甘油的 7H10 琼脂板上可以看到大量菌落（图 1D），而含丙酮酸钠的 7H10 琼脂板上在第 14 天仅看到少许菌落。牛分枝杆菌是一种专性需氧菌，在缺氧时会诱导 narX、narK2、dosR、hspX 和 frdA 的表达。为了衡量glpK 10C HT 菌株在两种培养基中的生长，我们监测了这些基因的转录水平。由于在甘油培养基中生长速度快，glpK 10C HT 菌株消耗氧气更快，缺氧诱导的 narX、narK2、dosR、hspX 和 frdA 表达升高。

(A-C) M. bovis glpK 7C HT菌株、glpK 8C HT 菌株和glpK 10C HT 菌株在甘油或丙酮酸钠培养基中的生长曲线。(D) M. bovis glpK 10C HT菌株在甘油固体培养基中生长的第12天的菌落。(E) M. bovis glpK 10C HT菌株在丙酮酸钠固体培养基中生长第14天时的菌落。(F) M. bovis glpK 10C HT菌株在甘油和丙酮酸钠培养基中mRNA的相对表达量。

图1  甘油促进M. bovis glpK 7C HT菌株和M. bovis glpK 10C HT菌株的生长

三、glpK 移码突变可影响牛分枝杆菌的抗结核药物敏感性

      为调查临床流行的牛分枝杆菌的耐药性，作者对来自中国的 60 株牛分枝杆菌分离株进行了药敏试验。检测到 9 个分离株（占总数的 15%）对受试药物表现出表型耐药。其中，德拉马尼耐药4株（6.67%），卡那霉素耐药4株（6.67%），乙硫异烟胺耐药2株（3.33%），异烟肼耐药1株（1.67%）。此外，2 株（3.33%）牛分枝杆菌同时对两种药物耐药。然而，在这些表型耐药分离株中没有发现任何已知的耐药基因突变。

      作者分析了不同glpK HT M. bovis菌株的MIC，发现glpK 9C HT菌株对9/14的评估药物表现出较低的药物敏感性，包括阿米卡星、莫西沙星、对氨基水杨酸、利福平、乙胺丁醇、利福布丁、左氧氟沙星、 氯法齐明和利奈唑胺（图2A-I）。此外，左氧氟沙星敏感性测试显示 glpK 8C HT 菌株的敏感性降低（图 2G）。作者也发现五种药物的 MIC 水平没有显着差异，包括异烟肼和贝达喹啉。

(A-F)通过测定MIC研究M. bovis glpK不同突变体的药物敏感性。（A）阿米卡星，（B）莫西沙星，（C）对氨基水杨酸，（D）利福平，（E）乙胺丁醇，（F）利福布丁，（G）左氧氟沙星，（H）氯法齐明，和（I）利奈唑胺。

图2 glpK突变可提高牛分枝杆菌的抗结核药物耐受性

四、牛分枝杆菌的生长速度可影响其药物敏感性

      作者使用基于甘油或丙酮酸钠的培养基测试了M. bovis glpK 10C HT菌株的药物 MIC。在受测的 12 种药物中，7 种药物在甘油培养基中的 MIC 低于丙酮酸钠培养基（表 4）。这表明M. bovis C68004 由于其在甘油培养基中的快速生长速度而对药物更敏感。

意义及展望

      综上所述，我们发现甘油可促进部分牛分枝杆菌的生长，而生长速度快的牛分枝杆菌对药物更敏感。M. bovis glpK HT 的移码突变与较低的药物敏感性有关。越来越多的证据表明，代谢相关突变有助于细菌耐药性的产生，研究细菌代谢与抗生素作用效果之间的关系有助于揭示新的耐药机制，并为新型药物的开发提供靶标。

      由于牛分枝杆菌可引起的人畜共患传染病。因此，在养牛生产中应限制和规范抗生素的使用，以防止耐药牛分枝杆菌对人类健康造成威胁。

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编辑：王   然

审校：郭   萌

发布日期：2022-04-26