一文读懂---荧光共振能量转移

2022
04/26

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检验之声
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《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》

作者:同济大学附属东方医院胶州医院--王晓燕

Fluorescence resonance energy transfer,FRET

2022年3月14日,《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》印发。方案提出,目前Omicron株感染病例已取代Delta株成为主要流行株。现有证据显示Omicron株传播力强于Delta株,致病力有所减弱。另外方案对解除隔离管理标准做了重大调整:轻型病例连续两次新型冠状病毒核酸检测N基因和ORF基因CT值均≥35(荧光定量PCR方法,界线值为40,采样时间至少间隔24小时),或连续两次新型冠状病毒核酸检测阴性(荧光定量PCR方法,界线值低于35,采样时间至少间隔24小时),可解除隔离管理。新方案更加充分的提高了医疗资源的利用效率,更加全面的体现了人民至上和生命至上的原则。

那么荧光定量PCR方法的CT值是怎么来的呢?这就不得不提到一个概念---荧光共振能量转移(FRET)。

FRET的概念

FRET首先是由Foster于1948年提出。当一个荧光基团R与一个荧光淬灭基团Q(可以淬灭前者的发射光谱)距离临近至一定范围时,就会发生荧光共振能量转移,淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光,从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭集团分开,淬灭作用即消失。FRET 程度与基团质检的空间距离紧密相关,一般为7~10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长,FRET呈显著减弱。基团之间FRET的效率,可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映,其中R表示基团之间的距离,R0表示福氏半径,依赖荧光基团发射谱和淬灭基团激发谱的重叠程度,以及基团能量转移的偶极子的相对方位。

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FRET的发生原理

荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中,如果一个荧光基团(供体 Donor)的发射光谱与另一个基团(受体 Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠,当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于100Å),就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象,即以前一种基团的激发波长激发时,可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说,就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程,此过程没有光子的参与,所以是非辐射的,供体分子被激发后,当受体分子与供体分子相距一定距离,且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时,处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体,使受体被激发,在整个能量转移过程中,不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零,则发生能量转移荧光熄灭;如果受体也是一种荧光发射体,则呈现出受体的荧光,并造成次级荧光光谱的红移。

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FRET的发生条件

能量供给体-接受体(D–A)对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的,主要包括:(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠;(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列;(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近,这样发生能量转移的几率才会高。此外,对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。可见,要找到一个合适的D–A对是很不容易的 。

FRET与CT值的关系

基于FRET原理,结合荧光信号采集系统,伴随PCR的过程,CT值应运而生。

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FRET技术的临床应用

目前,FRET技术广泛应用于分子诊断各个领域:TaqMan  probes 、双荧光标记的RT-PCR、分子信标探针等等

TaqMan  probes

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双荧光标记的

RT-PCR

66121650932586846  

分子信标探针

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FRET技术的学术进展

文献一:荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展

荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势,如:实现对活细胞的实时"可视化"研究,同时具有高时空分辨率;检测更加灵敏、结果可信度高;且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序。

文献二:荧光共振能量转移技术检测蛋白激酶A在MIN6细胞分泌胰岛素机制中的作用

基于FRET的生物传感器技术可在活细胞上实时动态检测PKA的变化,胰升血糖素以浓度递增的形式通过增加MIN6细胞内PKA的浓度来促进胰岛素分泌,且这种作用具有一定的葡萄糖依赖性。

文献三:牛血清蛋白纳米金团簇基于荧光共振能量转移法灵敏检测尿酸

基于纳米金团簇(AuNCs)良好的光学稳定性、生物相容性和简单无毒的制备方法,开发了一种具有高度选择性、高灵敏度且可视化的尿酸(UA)传感器。使用牛血清白蛋白(BSA)作为模板合成了BSA-AuNCs。在尿酸氧化酶的催化下,UA产生化学计量的过氧化氢(H_2O_2),导致AuNCs的荧光猝灭。此外,发现BSA-AuNCs在该体系模拟过氧化物酶发挥酶活性,它可以催化产物H_2O_2将底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine, TMB)氧化成ox-TMB,此时BSA-AuNCs的发射光谱与ox-TMB的吸收光谱重叠,发生了一种荧光共振能量转移(FRET)。

文献四:新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用

基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。

文献五:基于g-CNQDs的荧光共振能量转移法检测银离子

以尿素和柠檬酸钠为原料,采用低温固态法制备了催化相碳氮量子点(g-CNQDs),构建了基于g-CNQDs的荧光共振能量转移体系(FRET)。银离子(Ag~(+))通过与胞嘧啶(C)形成C-Ag~(+)-C复合物诱导3’-端修饰荧光素(FAM)的DNA序列折叠成发夹型结构,从而导致g-CNQDs与FAM间荧光共振能量转移效率发生改变,实现Ag~(+)的高灵敏检测。

END

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编辑:青翠欲滴

校审:晨晨

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关键词:
荧光,基团,共振,受体,能量转移

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