体内CAR-T细胞的技术路线

小编有话说

目前，CAR-T细胞是最成功的免疫细胞治疗种类。但是传统CAR-T仍然存在一些局限性，导致各研究机构/企业对CAR-T疗法进行优化，试图破局。在不断的发展和进步中，越来越多的CAR-T治疗策略被提出，“现货”CAR-T、“安全开关”CAR-T、双靶点CAR-T......纷纷涌现，造成目前CAR-T研究百花齐放的局面。

近年来，“体内构建”/“体内重编程”的 in vivo CAR-T成为一个新的CAR-T研究方向和热点，也涌现出了几条不同的技术路线分支，今天我们就来看一下这些体内CAR-T的不同之处。

CAR-T细胞治疗通常是在体外生产CAR-T，首先获取初始细胞，然后经过一系列的纯化、激活、转染、扩增、冻存、运输等流程，再将CAR-T细胞成品输入患者体内进行治疗。

但是“体内”CAR-T的提出，则是与传统的CAR-T大相庭径。首先，给患者输注的就不是CAR-T细胞成品，而是一个“引导物”，使得人体内的T细胞自己转变成CAR-T。

由于不需要体外生产CAR-T的过程，使得这种策略的CAR-T细胞治疗价格成本大幅度降低；同时不需要使用初始细胞，就没有细胞来源问题，不存在异体问题/免疫排斥问题。

也就是说，“体内”CAR-T有望成为一种真正的通用型CAR-T治疗方法。

纳米颗粒在体内编程CAR-T细胞

2017年4月，Nature Nanotechnology刊登了一篇文章，西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心的科研人员利用一种可生物降解的纳米颗粒对人体中的免疫细胞进行重编程，转变为CAR-T的方法。 该纳米颗粒同时包含CAR的表达基因，以及吸引并结合T细胞的分子；一旦T细胞被吸引吞噬掉纳米颗粒后，纳米颗粒中携带的CAR基因就会与细胞中的染色体结合，进而重编程为CAR-T细胞。研究人员表示，在24-48h内，T细胞会通过这个过程转化为CAR-T细胞。 在小鼠实验中也取得较为积极的结果，在白血病模型小鼠中输注了这种纳米颗粒，小鼠的白血病获得缓解，平均存活时间延长至少8周以上。值得注意的是，这种方法不需要进行化疗的预处理。 这是比较早的一篇研究文献了，但是当时CAR-T细胞还未获得上市，因此这篇研究在当时具有较高的前瞻性。 

mRNA技术体内重编程CAR-T 

年初的时候，也有一篇关于体内CAR-T的文章引起了广泛热议，并刊登在Science上作为封面文章。来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究团队利用能够编码CAR的mRNA LNP递送小鼠体内，成功在体内实现CAR-T细胞的生成并成功修复了小鼠的心脏功能。 总的来说，就是通过CD5靶向LNP将能够编码抗纤维化CAR的mRNA特异性靶向T细胞，利用mRNA的基因编辑功能将T细胞改造成抗纤维化CAR-T细胞，对活化成纤维细胞进行攻击，减少心脏纤维化。 是的， 与大多数CAR-T项目不同，该产品是针对非肿瘤疾病，而是针对的心血管疾病 。这也是基于mRNA转导的CAR-T持久性不长，对于肿瘤治疗来说，这可能是一种不足，但是对于心肌纤维化来说，更具有安全性。 这一文章的发表，使得很多企业开始了这个方向的尝试。 首先是Moderna和Carisma达成战略合作协议，结合Moderna的mRNA技术和Carisma的工程巨噬细胞技术，以发现、开发和商业化用于癌症治疗的mRNA LNP体内CAR-巨噬细胞（CAR-M）。 然后国内的远泰生物也在开发mRNA LNP体内CAR-T/NK，并且在2022 AACR上发布了mRNA-LNP在CAR-T领域的研究进展。 当然除了mRNA LNP体内CAR-T方向，也有很多企业开发了自己的体内CAR-T技术。 

利用病毒构建体体内转导CAR-T 

这个技术路线其实还是比较清晰的。 因为我们知道传统的体外生产的CAR-T，大多数是利用慢病毒/逆转录病毒进行转染T细胞而成的。而该路线，大致上来说，是将体外转染这一步放在了体内。 这边提一个代表公司和技术——Umoja Biopharma的VivoVec CAR-T。Umoja开发了一种专有的VivoVec体内递送技术，可以携带CAR的慢病毒直接给患者输注，然后再利用 RACR（Rapamycin Acivated Cytokine Receptor，雷帕霉素激活细胞因子受体）技术实现CAR-T细胞的快速制备和控制。

当然除了Umoja，还有不少公司/研究正在发展直接利用CAR病毒构建体转导体内CAR-T的项目。例如Mustang Bio的体内基因工程CAR-T细胞；EXUMA Biotech正在开发的皮下给药（rPOC）慢病毒构建体的体内CAR-T/TaNK； Abintus Bio与纪念斯隆·凯特琳癌症中心(MSK)合作的In Vivo CAR-X项目 等等，这里就不一一展开来叙述，有兴趣的读者可以自行查找相关的资料。 值得一提的是，Mustang Bio的体内CAR-T项目， 需要使用多肽药物驱动患者T细胞的增殖 ，然后将病毒构建体注入患者淋巴结，进行CAR-T细胞的生成。这一点也是体现到体内CAR-T细胞的一个问题，我们稍后总结会谈到。 但在使用病毒构建体直接在体内进行CAR-T转导的这一路线上，首先要面临的是安全性问题，以及是否需要化疗的预处理，和重复给药的可能性。 

Sana公司的Fusogen技术 in vivo  CAR-T 

在CAR-T领域，Juno公司还是比较有名的。首先是Juno公司先被新基（Celgene）收购，新基又被百时美施贵宝（BMS）收购；然后Juno公司原研的lisocabtagene maraleucel获得FDA批准上市。 而在 Juno公司 原班人马 打造的 Sa na Biotechnolog y，就有体内CAR-T的相关平台——Fusogen技术。Sana公司还有体外细胞工程，以及干细胞衍生平台等技术，但这边就暂且不提。Fusogen技术是Sana公司收购Cobalt公司获得的。 

Fusogen Technology——通过利用携带目标基因和Fusogen（一种天然蛋白质，能够介导人体内细胞间和细胞内融合事件）的Fusosome，靶向目标细胞，然后将载体融合进目标细胞中，进行基因组整合，进行体内细胞的重编程。

Sana使用的是来自副粘病毒科病毒的Fusogen，这个Fusogen蛋白复合体由受体识别G蛋白和膜融合F蛋白组成，Sana还可以通过对G蛋白进行改造而获得高度选择性的Fusogen，如添加scFvs、VHHs或DARPins，使得能够靶向不同的细胞类型（包括T细胞、肝细胞或造血干细胞）。

目前，Sana公司基于Fusogen技术已经开发了多个临床前管线，适应症涵盖了肿瘤学、罕见病。其中 Fusogen CD19 CAR-T项目在小鼠试验中取得较为积极的结果 ，通过IV给药Fusosome体内构建CD19 CAR-T可以清除人源化小鼠体内的B细胞肿瘤。 可植入支架MASTER 最近，北卡罗来纳州立大学和北卡罗来那大学的研究人员开发了一种名为MASTER (Multifunctional Alginate Scaffold for T Cell Engineering and Release)的多功能藻酸盐支架，MASTER技术集成了T细胞激活、重编程和体内扩增的步骤，将制造CAR-T的时间缩短到1天。

延伸阅读：120万的一针的CAR-T实现体内一天生产，期待成本下降 ！

首先通过从患者身上分离出T细胞，并将未激活的T细胞与装载CAR的病毒载体进行混合。再将这种混合物倒在MASTER上，随后将MASTER注入小鼠体内。支架有激活T细胞的抗体，可以快速激活T细胞；此外，MASTER材料还含有IL-2，MASTER植入体内后，IL-2开始渗出，促进CAR-T细胞的快速增殖。 科学家们还在淋巴瘤小鼠模型中进行了试验。一组接受了MASTER CAR-T，第二组接受了常规静脉注射的CAR-T细胞治疗，对照组接受非工程化T细胞。研究发现，接受 MASTER技术生产的CAR-T细胞表现出更好的治疗效果。 但是这种方法在实际进入临床前还有更多的工作要进行，首先需要在多种动物模型中验证MASTER技术的安全性和有效性。此外，主植入物需要通过手术植入体内，手术伤口也需要评估。 

总结 

在这两年内，体内构建CAR-T的研究开始慢慢增多，直到现在成为一个比较受关注的方向。

但值得注意的是，对比CAR-T来说，体内构建CAR-T安全性的问题可能会更具有挑战性。尤其是直接利用病毒构建体的技术路线来说，毕竟利用病毒的基因治疗也因为病毒载体的特殊性而导致几次受挫。

同时，也需要考虑其他问题，例如免疫细胞数量问题。对于癌症患者来说，当患者未来入组时，此前已经接受了多线治疗，体内免疫细胞的数量和质量已经很差，能否对于病毒构建体或者其他“引导物”产生响应，以产生足够的CAR免疫细胞进行肿瘤杀伤。

此外，靶向性问题、递送效率问题、毒性问题都是需要考虑的。

参考资料： 1.http://sciencebusiness.technewslit.com/?p=30725   2.文内各大公司官网