尿液「细胞外囊泡」用于糖尿病肾脏疾病早期诊断指标的研究与临床前景 | 专家论坛

（图片来源：摄图网） 

中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南列出的DKD常用临床评估指标是尿白蛋白含量和估算的肾小球滤过率 （estimated glomerular filtration rate, eGFR） 。 但，通过对DKD经典模型的研究发现，DKD关于尿白蛋白含量的临床表现为持续渐进性蛋白尿。来自不同国家地区的多个临床研究也发现，存在尿白蛋白正常但肾脏受损的DKD患者，即尿白蛋白正常的DKD （normoalbuminuric diabetic kidney disease, NADKD） 。2017年，Chen等命名了这种疾病并就其流行病学史、病理生理机制和临床表现进行了阐述，指出这类患者更易出现肾脏弥漫性病变、缺血性病变、肾小管间质性病变及大血管病变 [4] 。这表明， 尿白蛋白做为早期DKD诊断指标存在一定局限性，需要寻找更好的临床评估指标来进行DKD的早期诊断 。 尿液细胞外囊泡 （extracellular vesicles，EVs） 就是一个比较好的选择。 Raimondo F等人以Zucker糖尿病肥胖大鼠作为T2DM模型，比较其尿液和尿EV蛋白质组学特征，分析发现，尿EVs中蛋白种类与尿液完全不同，表明相较于尿液蛋白质组，尿EVs内容物更能代表肾小球和肾小管的改变 [17] 。 在DKD早期，尿EVs主要来源于肾单位和集合管 [18] 。分析尿液中EVs的数量、种类及内容物，有助于找到新的DKD风险评估生物标志物和治疗靶标，作为肾功能不全和结构损伤的早期诊断指标。 

01  尿EVs中反映肾小球早期损伤的标志 CD133是肾祖细胞表达的一种蛋白，也可用于评估 DKD进展。从微量蛋白尿和大量蛋白尿分析看，随着DKD的发展，尿液中含CD133的EVs数量逐渐减少，尿EVs中CD133的含量可以反应肾小球损伤情况 [19] 。 Burguer等人通过流式细胞术检测了四种糖尿病模型中足细胞来源的EVs量，发现尿中含足细胞标志蛋白podocalyxin的EVs数量在蛋白尿出现之前就会增加，这表明 足细胞来源的尿EVs数量增加可能是糖尿病患者足细胞损伤的早期敏感指标 [20] 。Wilm’s tumor-1（WT1）是一种出现在尿液中的蛋白质，与DKD肾功能损伤相关 [21] 。但尿液中WT1的检测会因受到白蛋白尿的干扰而不易实现。体外细胞实验表明，高糖环境下足细胞会产生富含WT1 mRNA的EVs [22] 。临床实验也发现，DKD患者尿EVs中WT1 mRNA明显增加，这类EVs对评估DKD发展程度有一定意义 [22] 。 体外研究表明用糖基化终末产物处理足细胞后，细胞分泌的EVs中上皮特异性转录因子3 （epithelium-specific transcription factor 3, Elf3） 的量增加， Elf3的水平可作为足细胞的标志物用于评估T2DM患者的肾损伤，作为DKD足细胞损伤早期标志物 [23] 。 

02  尿EVs中反映肾小管早期损伤的标志 高糖刺激下，足细胞释放的EVs中的miRNA-221通过Wnt/β-catenin信号通路诱导PTCs去分化，以及通过增加纤连蛋白、IV型胶原、p38和Smad3的磷酸化来激活PTCs的纤维化反应 [24] 。此外，还有实验表明这类EVs中的5个miRNA（miR-1981-3p, miR-3474, miR-7224-3p, miR-6538和let-7f-2-3p）参与了PTECs凋亡 [25] 。 在健康对照组、无肾损伤的糖尿病患者组和DKD患者组发现，尿EVs中的水通道蛋白1（PTECs标志物）在三组没有差异，DKD患者组尿EVs富集促纤维化TGF-β信号通路的早期靶标CD73，这表明 尿EVs中CD73可用于评估eGFR下降之前的糖尿病肾小管损伤 [26] 。 

03  EVs中miRNAs表征DKD病程 RNA测序发现T1DM患者尿液和尿EVs中miRNAs存在明显差异，有些miRNAs在尿EVs含量较为丰富 [27] 。在对明显、间歇性或持续性微量白蛋白尿的患者进行随访中发现， 在DKD发展过程中存在不同阶段尿EVs中特有的miRNAs [27] 。目前，增加的miRNA有miR-145、miR-192、miR-194、miR-215、let-7i-3p、miR-24-3p、miR-27b-3p、miR-362-3p、miR-877-3p、miR-150-5p、miR-21-5p 和 miR-26a，降低的miRNA有miR-15b-5p 和 miR-30b-5p [14, 28-32] 。 此外，有生物信息学分析研究推测尿EVs中let-7i-3p、miR-24-3p、miR-27b-3p和miR-15b-5p可能参与Wnt/β-catenin信号通路、激活素受体信号通路和细胞分化增殖等，而miR-362-3p、miR-877-3p和miR-150-5p与p53、mTOR和AMPK信号通路相关 [29] 。 Park等人使用三种方法比较了来自DKD患者尿液EVs的miRNAs。发现尽管获得的尿EVs量存在差异，但有22个miRNAs表达相似 [33] 。 此外，一些研究通过细胞和动物模型探讨了某些miRNA的生物学作用。例如，Zheng等人观察到用TGFβ1处理肾脏TPECs会释放富含miR-26a的EVs [32] 。Barutta等人报道高糖培养的系膜细胞释放富含miRNA-145的EVs [28] 。miR-145表达于糖尿病小鼠的肾小球，糖尿病小鼠尿液中含miR-145的EVs是非糖尿病小鼠的2倍，这表明 miRNA-145可作为DKD生物标志物，同时也是DKD调节因子 [28] 。

就目前的研究而言，尿EVs能更好地反映糖尿病刺激下肾小球和肾小管细胞的早期病变。但仍需要大量的临床研究来筛选与DKD病程表型密切相关的具体生物标志物，如蛋白质、mRNA 或 miRNA等。此外，成熟的EVs分离纯化技术也是尿EVs分析能否应用于临床检验的一个必备条件。随着研究的深入，尿EVs作为糖尿病肾脏疾病诊断指标的前景必然会成为更加明朗，成为DKD的早期诊断的良好指标。

 （ 作者：刘瑜  刘建广 牛文彦 ）

【参考文献】

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