快报 | 结核分枝杆菌特定rpoB突变致临界利福平耐药：Xpert MTB/RIF检测优于现有标准表型药敏试验方法

Detection of Mycobacterium tuberculosis Rifampicin Resistance Conferred by Borderline rpoB Mutations: Xpert MTB/RIF is Superior to Phenotypic Drug Susceptibility Testing 

Xia H, Song Y, Zheng Y, Wang S, Zhao B, He W, Liu D, Ou X, Zhou Y, Zhao Y. 

Infect Drug Resist, 2022, 15: 1345-1352.

doi:10.2147/IDR.S358301.

PMID: 35378895. 

近日，《感染与药物耐药》（Infection and Drug Resistance）杂志发表了一项关于表型药物敏感性试验（简称“药敏试验”）和基因型药敏试验检测特定rpoB突变致临界利福平耐药的研究（Detection of Mycobacterium tuberculosis Rifampicin Resistance Conferred by Borderline rpoB Mutations: Xpert MTB/RIF is Superior to Phenotypic Drug Susceptibility Testing. Xia H, Song Y, Zheng Y, et al. Infect Drug Resist. 2022, 15: 1345-1352. doi:10.2147/IDR.S358301）。研究主要评估了中国临床广泛应用的罗氏培养基比例法药敏试验、最低抑菌浓度法及基因型药敏试验对世界卫生组织界定的7种rpoB突变导致的临界利福平耐药的检测性能。中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心的夏辉为文章的第一作者，赵雁林主任为通信作者。

研究背景

中国是结核病和耐多药/利福平耐药结核病（multidrug-resistant/rifampicin resistant tuberculosis，MDR/RR-TB）高负担国家之一。2019年，世界卫生组织估算中国有65 000（49 000～83 000）例MDR/RR-TB患者。与MDR/RR-TB估算患者数相比，实验室确诊的MDR/RR-TB患者比例仅为28.1%。

近年来，分子检测能力不断加强，根据可用的检测技术在不同地区实施了不同的诊断流程。约50%的县（区）级定点医疗机构使用Xpert MTB/RIF作为初始结核病实验室诊断工具。其他地方使用抗酸杆菌涂片显微镜检查、培养或其他分子生物学检测技术如环介导等温扩增等对结核分枝杆菌进行检测，病原学阳性标本或菌株转运至地市级实验室，并通过基因型（如线探针试验等）或表型药敏试验进行利福平耐药性检测。已有研究表明，快速液体培养系统如分枝杆菌生长指示管（MGIT 960）系统无法检测到某些具有临界利福平耐药的菌株，其中大部分是由世界卫生组织定义的一些临界rpoB突变引起的，如His445Leu、Asp435Tyr、Leu452Pro、Leu430Pro、His445Asn、Ile491Phe 和 His445Ser。因此，如果仅使用快速液体系统检测具有临界rpoB突变菌株的结核感染患者，可能会被诊断为利福平敏感，进而会接受标准的基于利福平的一线抗结核药物治疗方案，最终导致治疗失败或复发。目前，世界卫生组织已推荐将MGIT 960和Middle brook 7H10的利福平药敏试验临界浓度降至0.5 μg/ml，但对于使用当前临界浓度（40.0 μg/ml）的固体比例法药敏试验检测临界利福平耐药性则需要进一步研究，以提供更多的数据支持。特别是在中国，基于改良罗氏培养基的药敏试验仍然是一种广泛使用的方法。

全基因组测序技术的应用使得不同国家和地区了解了临界rpoB突变的结核分枝杆菌的流行状况。中国的一项研究显示，临界rpoB突变占检测到的总rpoB突变的20.4%。基于中国较高的临界rpoB突变菌株的流行状况和固体比例法药敏试验的使用状况，本研究比较了表型药敏试验与基因型利福平耐药检测方法（Xpert MTB/RIF）对临界利福平耐药的检测效能。

研究方法

1.菌株来源：收集来自全国70个县的具有合格基因组测序结果的4922株结核分枝杆菌菌株，发现有84株具有临界rpoB耐药相关突变，其中62株具有单一临界rpoB突变，但5株传代培养失败，最终57株菌株纳入分析。

2.全基因组测序：使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取基因组DNA。使用Illumina Hiseq2500（Illumina, Inc., San Diego, CA）进行2×150双末端（PE）DNA全基因组测序。

3.Xpert MTB/RIF检测：使用1.0 McFarland浓度菌悬液的100倍稀释液进行Xpert MTB/RIF测定。操作按照厂家说明书进行。

4.罗氏培养基固体比例法药敏试验：利福平药敏试验按照世界卫生组织推荐的临界浓度40.0 μg/ml进行。菌悬液接种后分别在孵育的第4周和第6周时判读结果。每个批次中均包含作为对照的结核分枝杆菌H37Rv菌株（ATCC 27294）。

5.最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration test，MIC）测定试验：使用利福平浓度范围为0.03～2.0 μg/ml的微孔板法（Thermo Fisher, Scientific Inc., USA）进行MIC测定试验。每个测试批次中均包含作为对照的结核分枝杆菌H37Rv菌株（ATCC 27294）。分别依据1.0 μg/ml和0.5 μg/ml的临界浓度对利福平的耐药性进行判读。

研究结果

1.具有临界rpoB突变的菌株特征：57株有单一临界rpoB突变的菌株中包括3株（5.2%）Asp435Tyr、9株（15.8%）His445Asn、4株（7.0%）His445Leu、2株（3.5%）His445Ser、3株（5.3%）Ile491Phe、18株（31.6%）Leu430Pro及18株（31.6%）Leu452Pro。51株（89.5%）为家系2，6株（10.5%）为家系4。43株（75.4%）菌株中发现了katG、ahpC或fabG1基因存在异烟肼耐药相关突变或插入缺失。

2.Xpert MTB/RIF、罗氏培养基固体比例法药敏试验和MIC测定试验的结果比较：使用Xpert MTB/RIF检测出84.2%（48/57）的菌株对利福平耐药；使用罗氏培养基固体比例法药敏试验在孵育的第4周和第6周后分别检出43.9%（25/57）和57.9%（33/57）的菌株对利福平耐药；使用MIC测定试验分别在1.0 μg/ml和0.5 μg/ml的临界浓度下检出52.6%（30/57）和70.2%（40/57）的菌株对利福平耐药。Xpert MTB/RIF对利福平菌株临界耐药的检出率明显高于其他方法（χ2=23.98，P＜0.001）（表1）。

注  括号外数值为“菌株株数”，括号内数值为为“率（%）”。a: 罗氏培养基固体比例法药敏试验在孵育第6周时的结果判读；b: 罗氏培养基固体比例法药敏试验在孵育第4周时的结果判读；c: 最低抑菌浓度测定试验的临界浓度为1.0 μg/ml；d：最低抑菌浓度测定试验的临界浓度为0.5 μg/ml

尽管Xpert MTB/RIF可以检测到大部分的临界利福平耐药（表2），但利福平耐药性决定区（RRDR）外的3株Ile491Phe突变株和RRDR区域内的3株Leu452Pro、1株His445Asn、1株His445Leu、1株Leu430Pro突变株使用Xpert MTB/RIF未检测到耐药。相比较来说，比例法药敏试验和MIC测定试验则遗漏了大部分的Leu430Pro突变；而对于Leu452Pro突变株，比例法药敏试验在孵育的4周后仅检测到50%的突变菌株。

注  括号外数值为“菌株株数”，括号内数值为为“率（%）”。a: 罗氏培养基固体比例法药敏试验在孵育6周的结果判读；b: 罗氏培养基固体比例法药敏试验在孵育4周的结果判读；c: 最低抑菌浓度测定试验的临界浓度为1.0 μg/ml；d：最低抑菌浓度测定试验的临界浓度为0.5 μg/ml

3.不同临界rpoB突变菌株的MIC分布：57株不同rpoB突变菌株中，5株（8.8%）MIC为0.25 μg/ml或0.12 μg/ml、22株（38.6%）为0.5 μg/ml或1.0 μg/ml、30株（52.6%）≥2.0 μg/ml。值得注意的是，在发生Leu430Pro或Leu452Pro突变的菌株中，83.3%（15/18） 和66.7%（12/18）菌株的MIC在1.0 μg/ml或0.5 μg/ml临界浓度的1～2倍稀释范围内。而对于Leu430Pro或Leu452Pro突变菌株，Xpert MTB/RIF和比例法药敏试验对孵育6周后检测不一致结果的主要归因为低MIC值（≤2.0 μg/ml）（图1）。

注  X_R/L-J_R：Xpert MTB/RIF耐药/L-J DST耐药，以红色表示；X_R/L-J_S：Xpert MTB/RIF耐药/L-J DST敏感，以蓝色表示；X_S/L-J_S：Xpert MTB/RIF敏感/L-J DST敏感，以绿色表示；X_S/L-J_R：Xpert MTB/RIF敏感/L-J DST耐药，以紫色表示

图1  不同rpoB突变的Asp435Tyr（A）、His445Asn（B）、His445Leu（C）、 His445Ser（D）、Ile491Phe（E）、Leu430Pro（F）和Leu452Pro（G）菌株的MIC分布情况 

研究结论

本研究比较了固体比例法表型药敏试验及MIC测定试验在现有推荐的临界浓度下与基因型药敏试验对检测临界利福平耐药的效果，发现基于分子的Xpert MTB/RIF基因型药敏试验显示出更好的检测临界利福平耐药性的能力。若将罗氏培养基比例法药敏试验的孵育时间延长至6周或将MIC测定试验的临界浓度降低至0.5 μg/ml则可提高临界利福平耐药的检出能力，提示应继续扩大Xpert MTB/RIF等分子生物学检测技术的应用规模，更重要的是提高其对患者的可及性。未来需要更多的特定突变类型的样本进一步验证。

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编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-04-21