ADC药物的耐药机制

2022
04/23

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BiG生物创新社
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高抗原表达也可能会降低 ADC 的有效性。

一、ADC的作用机制

进入体内后,抗体部分与肿瘤细胞表面的靶向抗原结合 ,肿瘤细胞会将 ADC 分子内吞。其中一部分能够与内体中的 Fc 受体结合,从而一部分 ADC 被转运到细胞表面并通过FcRn介导的转胞吞作用释放到胞外,而其他ADC-抗原复合物则进入溶酶体,溶酶体中的酶或者酸性环境可降解ADC,从而释放出有细胞毒性的化学药物,破坏 DNA 或阻止肿瘤细胞分裂,起到杀死肿瘤细胞的作用。

二、ADC产生耐受的原因

ADC结构的任一组分发生异常或在周期性治疗压力下都会导致耐药性的产生。ADC的耐药机制可能包括ADC暴露压力过大;靶点抗原下调、缺失或抗原基因突变;内化途径的缺失;溶酶体蛋白水解功能降低;溶酶体转运蛋白突变;细胞周期停滞;药物外排转运蛋白表达异常;下游信号通路被激活;凋亡失调等等。

60441650497516832 ADC的作用机制及其产生耐受性的可能原因

图片来源:Resistance toAntibody–Drug Conjugates. Cancer Res 1 May 2018; 78 (9): 2159–2165.

81551650497516782 三、抗原相关耐药

多次暴露ADC会诱导肿瘤细胞产生耐受。例如:多次暴露于抗HER2的会使HER2阳性乳腺癌细胞系对T-DM1产生抗性。这也是目前构建ADC耐药小鼠模型的常规实验手段。

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用 TM-ADC和纯药物DM1-SMe处理的亲代细胞和耐药细胞的细胞毒性特征

图片来源:Mol Cancer Ther. 2015 Apr;14(4):952-63.doi: 10.1158/1535-7163.MCT-14-0862. Epub 2015 Feb 2. PMID: 25646013

矛盾的是,高抗原表达也可能会降低 ADC 的有效性。这种情况主要发生在‍Gemtuzumab ozogamicin(Mylotarg®)‍,外周血中高 CD33 抗原负荷是一个独立的不良预后因素,Gemtuzumab 静脉输注导致外周血中CD33 完全饱和,与相应外周血样本中的 CD33 饱和度(>90%)相比,骨髓中的 CD33 饱和度显著降低(40-90%)。显然,血液中的高 CD33 抗原负荷会消耗吉妥珠单抗,从而限制其渗透到骨髓中。这可能也是Gemtuzumab ozogamicin仅在大约 30% 的复发性 AML 患者中诱导缓解的原因

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图片来源:HighCD33-antigen loads in peripheral blood limit the efficacy of gemtuzumabozogamicin (Mylotarg) treatment in acute myeloid leukemia patients. Leukemia.2004 May;18(5):983-8. doi: 10.1038/sj.leu.2403350. PMID: 15029214.

抗原胞外域的截断或细胞外基质成分的掩蔽可能与 对曲妥珠单抗的耐药机制有关。过表达 HER2 的肿瘤亚组也表达 p95HER2,这是一种具有激酶活性的氨基末端截短受体。在 46 名接受曲妥珠单抗治疗的 HER2 过表达晚期乳腺肿瘤患者的样本中,通过免疫荧光评估 p95HER2 的表达。显示了 p95HER2与曲妥珠单抗耐药性直接相关( P = .029,使用双边卡方检验计算)。

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图片来源:Expression of p95HER2, a truncatedform of the HER2 receptor, and response to anti-HER2 therapies in breastcancer. J Natl Cancer Inst. 2007 Apr 18;99(8):628-38. doi: 10.1093/jnci/djk134.

抗原配体的存在可能影响对ADC的敏感性。研究表明,促进 HER2 与 HER3 和 HER4 异二聚化的配体(如神经调节蛋白NRG-1β)会削弱 T-DM1 的功效。NRG-1β 对HER2 扩增的乳腺癌细胞系中 T-DM1 活性的影响(如下图)。A、BT-474、SK-BR-3 和ZR-75-30:NRG-1β (2 nmol/L)几乎完全抑制 T-DM1活动(左)。右图显示 NRG-1β 对 T-DM1 活性的剂量依赖性降低。

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图片来源:Dualtargeting of HER2-positive cancer with trastuzumab emtansine and pertuzumab:critical role for neuregulin blockade in antitumor response to combinationtherapy. Clin Cancer Res. 2014 Jan 15;20(2):456-68. doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-0358. Epub 2013 Oct 4. PMID: 24097864.

四、内化和转运至溶酶体途径缺陷

抗体与靶点结合后被内吞到细胞中。内吞作用可以通过不同的内化途径发生,例如网格蛋白介导 (CME)、小窝蛋白介导和网格蛋白-小窝蛋白非依赖性内吞作用。据报道,CME 是各种 ADC 采用的中心路线

小窝蛋白介导的内吞作用是一种新的Trastuzumab-emtansine(T-DM1)耐药机制。图E表明N87-TM(T-DM1 耐受的N87 细胞)富含细胞内小窝蛋白,并通过小窝蛋白的内吞作用将曲妥珠单抗-ADC 内化。图F表明随着时间的推移,N87-TM细胞显示出增强的曲妥珠单抗和 CAV1 共定位。由于T-DM1 在溶酶体中分解代谢,N87-TM 细胞中曲妥珠单抗的溶酶体共定位降低,故T-DM1向溶酶体的递送效率低下9681650497520003 图片来源:Caveolae-Mediated Endocytosis as aNovel Mechanism of Resistance to Trastuzumab Emtansine (T-DM1). Mol CancerTher. 2018 Jan;17(1):243-253. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-17-0403. Epub 2017 Oct20. PMID: 29054985. 

五、溶酶体功能障碍 1.溶酶体 pH 较高,导致蛋白水解活性受损

ADC需要到达溶酶体,然后细胞毒剂通过化学或酶促切割释放。在长期暴露于药物而对 T-DM1 产生抗药性的细胞中,已观察到T-DM1在溶酶体积累。在这些细胞中,药物到达溶酶体区室,但蛋白水解活性低于敏感细胞中的蛋白水解活性。这种缺陷是由于溶酶体 pH 值升高,这反过来又抑制了溶酶体蛋白水解酶活性。

为了评估T-DM1 是否在溶酶体内处于酸性环境。有研究者克隆了C#1、C#3 和 C#6三种耐受性逐渐减弱的细胞系,T-DM1 用 pHrodo标记(红色荧光染料,在中性 pH 下几乎不发荧光,但在酸性环境中发荧光)。显微镜或 FACS下观察到荧光在BT474和C#6细胞积累( 图7A )。相反,在 C#1 和 C#3 细胞中,荧光信号要弱得多。 接下来测定组织蛋白酶 B 活性。C#6的组织蛋白酶B活性与野生型BT474细胞相似( 图7C)。相反,在克隆 C#1 和 C#3 中观察到显著降低的组织蛋白酶 B 活性。 总之,上述数据表明 C#1 和 C#3 中的溶酶体 pH 较高,这可能导致整体蛋白水解活性受损,从而阻止了 T-DM1 的充分切割79591650497520241 图片来源:Resistance to the Antibody-Drug Conjugate T-DM1 Is Based in aReduction in Lysosomal Proteolytic Activity. Cancer Res. 2017 Sep1;77(17):4639-4651. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-16-3127. Epub 2017 Jul 7. PMID:28687619. 2.溶酶体转运蛋白受损

对 ADC 耐药的另一种机制与细胞毒剂从溶酶体腔转运到细胞质有关。这与不可切割接头的 ADC 具有相关性,ADC的分解代谢会释放连接在氨基酸残基上的接头-细胞毒剂。溶酶体膜对这些分解代谢物是不可渗透的,需要运输机制将它们从溶酶体腔运输到胞质中。     

为了识别潜在的溶酶体转运蛋白,Hamblett 及其同事使用基于抗 CD70-美登素的 ADC 进行了表型shRNA 筛选。该筛选鉴定了溶酶体膜蛋白 SLC46A3,其遗传衰减抑制了多种基于美登素的不可切割ADC 的效力,包括 T-DM1。相比之下,携带结构不同的MMAF的不可切割 ADC 的转运效力不受 SLC46A3 衰减的影响

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SLC46A3 对赖氨酸-MCC-DM1 浓度的功能影响

图片来源:SLC46A3 Is Required to Transport Catabolites of NoncleavableAntibody Maytansine Conjugates from the Lysosome to the Cytoplasm. Cancer Res.2015 Dec 15;75(24):5329-40. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-15-1610. Epub 2015 Dec2. PMID: 26631267.

六、药物外排泵  

由于ATP 结合盒式转运蛋白(ABC)的过度表达,药物从细胞中排出,抑制了抗癌剂的细胞毒性作用,这是人类恶性肿瘤多药耐药 (MDR) 的主要原因。这些药物外排泵也可能导致对 ADC 的耐药性,因为许多细胞毒剂是 ABC 转运蛋白的底物。

MDR1 活性与患者预后显著相关。已经观察到,与无反应者相比,Gemtuzumab ozogamicin (GO)反应的 AML 原始细胞具有显著降低的 MDR1 活性。另外有研究者确定了 P-gp(ABCB1/MDR1) 是对基于 vc-MMAE 的缀合物产生抗性的主要驱动因素。通过流式细胞术(图A)和罗丹明 123 的流出功能测定(图B)证实了P-gp 的上调。BJAB.Luc-22R1.2 和WSU-22R1.1 细胞系的 P-gp 蛋白表面表达比亲代细胞系高约 100 倍。此外,两种细胞系都失去了保留罗丹明 123 信号的能力,表明 P-gp 介导的主动外排。这两种细胞系在 P-gp 抑制剂处理后恢复了它们的罗丹明 123 信号,进一步证明了 P-gp 的功能。美登素也是 MDR1 等药物转运蛋白的底物,因此对 T-DM1 等 ADC 的抗性也可能与MDR1 活性有关。 45281650497521055

图片来源:A Novel Anti-CD22 Anthracycline-Based Antibody-Drug Conjugate (ADC)That Overcomes Resistance to Auristatin-Based ADCs. Clin Cancer Res. 2015 Jul15;21(14):3298-306. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-2035. Epub 2015 Apr 3. PMID:25840969.

七、细胞周期的作用  

细胞周期蛋白 B 是一种参与 G2-M 转变的细胞周期蛋白,细胞周期蛋白 B 的沉默导致对药物的耐药性。有研究观察到,在对T-DM1 敏感的 HER2 + 乳腺癌细胞中,该药物导致细胞周期蛋白 B 的增加,而在对 T-DM1 产生抗性的细胞中没有观察到这种增加。有研究者用针对细胞周期蛋白B1 mRNA的siRNA转染细胞系,发现细胞周期蛋白B1水平显著低于sicontrol;通过测定细胞活力发现沉默细胞周期蛋白B在三个亲本细胞系中诱导了对 T-DM1 的显著抗性(图A)。

65061650497521245 图片来源:Defective Cyclin B1 Induction in Trastuzumab-emtansine (T-DM1)Acquired Resistance in HER2-positive Breast Cancer. Clin Cancer Res 15 November2017; 23 (22): 7006–7019. 

八、信号通路的激活

激活的 PI3K/AKT 信号传导可能会产生ADC抗性。AKT小分子变构抑制剂 MK-2206 使耐药细胞对gemtuzumab ozogamicin(GO)或游离加利车霉素变敏感。一项临床研究目前正在探索 T-DM1 与 PI3K 抑制剂组合的安全性和早期疗效迹象(NCT02038010)

82811650497521467 图片来源:AKT signaling as a novel factor associated with in vitro resistanceof human AML to gemtuzumab ozogamicin. PLoS One. 2013;8(1):e53518. doi:10.1371/journal.pone.0053518. Epub 2013 Jan 8. PMID: 23320091; PMCID:PMC3539972.   

九、凋亡失调

凋亡情况的变化也可能调节对 ADC 的敏感性。抗凋亡蛋白 BCL-2 和 BCL-X 的过表达与gemtuzumab ozogamicin(GO)抗性有关,有研究表明PK11195 可以增加表达抗凋亡蛋白和药物转运蛋白的 AML 细胞中的 GO 细胞毒性。并发现 PK11195 可以在小鼠模型中安全地增加 GO 的抗白血病活性;另外,Oblimersen 选择性靶向 Bcl-2 mRNA,在临床前研究中显示可增强各种抗白血病药物(包括GO)的凋亡活性;在 NHL 细胞系中,Dornan 及其同事发现 BCL-XL 的表达水平与抗 CD79b-缬氨酸-瓜氨酸-MMAE 敏感性降低相关。体内数据显示,BCL-2 家族抑制剂 ABT-263 增强了 ADC 的活性。

33241650497521660 图片来源: The peripheralbenzodiazepine receptor ligand PK11195 overcomes different resistancemechanisms to sensitize AML cells to gemtuzumab ozogamicin. Blood. 2004 Jun1;103(11):4276-84. doi: 10.1182/blood-2003-11-3825. Epub 2004 Feb 12. PMID:14962898.

十、总结

药物耐受性仍然是肿瘤学中的一个主要问题,ADC的结构提供了修改其部分组件以开发能够克服耐药性的新化合物的可能性。除了一些已充分描述的机制(例如药物外排泵)外,人们对潜在耐药性的分子机制知之甚少。最近有研究描述了与 ADC 的细胞生物学相关的新的可能耐药机制,这为治疗带来了启示。ADCs 未来的临床开发可能更偏向于对耐药机制的研究和最佳药物的筛选,以最大限度地提高其治疗效果。

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关键词:
溶酶体,活性,细胞,药物,蛋白

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