精品文献|炙手可热的mRNA技术，还不抓住机会？

关键词

体外转录，mRNA疫苗，mRNA药物，肿瘤靶向治疗，基因修饰动物模型，小鼠，斑马鱼，果蝇

过去在很多人的印象里，生物药领域的宠儿可能会是DNA或蛋白质。基因治疗技术创新和临床试验在近几年如雨后春笋般涌现，这也将DNA层面的疾病治疗推向了聚光灯下。另一方面抗体药的爆发式增长也给蛋白表达市场注入了巨大能量。2020年的新冠疫情，犹如黑天鹅事件， 让mRNA技术瞬间成为了万众瞩目的焦点。其实，mRNA 技术用途极为广泛，除了可用于制备疫苗，还可用于基因编辑、蛋白质替代疗法、细胞工程改造等多种研究场景。体外转录可以说是mRNA研究中经典的一步，提高加帽mRNA得率，减少模板DNA的残留，是体外合成加帽mRNA始终追求的目标。

mRNA疫苗

随着疫情的冲击， mRNA 技术进入了新的发展快车道，而作为未来的防疫之盾的mRNA 疫苗也因新冠疫情变得万众瞩目。其实在此之前，已经有很多mRNA疫苗的研究成果发表在世界顶级学术期刊上，在2017年Cell的一篇重磅文章 “Modified mRNA Vaccines Protect against Zika Virus Infection”里，作者通过体外转录mRNA，开发了一种脂质纳米颗粒 (LNP) 递送的寨卡病毒mRNA 疫苗，编码野生型或变异 ZIKV 结构基因(prM-E)，成功在小鼠中产生了免疫原性和保护作用。此经修饰的非自我扩增 mRNA 疫苗具有优化的 mRNA结构，其中包含编码目标抗原的开放阅读框、5’和 3’可提高翻译效率和细胞内稳定性的非翻译区，以及独特的核苷修饰以最大限度地减少先天免疫的排斥作用 。作者评估了 IgEsig-prM-E LNPs 在缺乏 I 型和 II 型干扰素 (IFN) 信号反应的免疫功能低下的小鼠中的免疫原性和保护活性。在免疫后第 42 天，对小鼠进行抽血以进行血清中和抗体分析（图 1F）。实验组小鼠均产生抗体中和反应，接受肌肉注射 IgEsig-prM-E LNPs及加强刺激的小鼠对 ZIKV 具有最强的血清中和反应。

值得提到的是，该研究是和彼时还未成长为mRNA疫苗行业巨头的Moderna合作完成。同年6月，该研究小组继续和Moderna合作在Cell上发表重磅文章 “Vaccine Mediated Protection Against Zika Virus-Induced Congenital Disease”。在该研究中作者进一步研发了寨卡病毒灭活疫苗，利用T7 mMessage mMachine kit (AM1344, Invitrogen) 体外转录得到去糖基化的NS1 mRNA，并将其电转进Vero细胞，经处理后得到寨卡病毒灭活疫苗。作者发现给孕期小鼠注射mRNA和灭活疫苗均可防止寨卡病毒母胎传播。作者在胚胎发育第 6 天 (E6) 用异源 ZIKV 毒株感染已接种疫苗的孕鼠，发现在 第13天母体、胎盘和胎儿组织中的病毒 RNA 水平显著降低，结果表明给孕鼠接种疫苗从而防止胎盘损伤和胎儿死亡，如下图所示。

mRNA药物肿瘤靶向治疗

原发性肝癌是最常见的肝癌，其特点是死亡率高、预后差。近期在Nature Communications的一篇文章“Combining p53 mRNA nanotherapy with immune checkpoint blockade reprograms the immune microenvironment for effective cancer therapy”中，来自哈佛大学医学院的施进军教授团队与合作者麻省总医院的Dan G. Duda教授团队合作开发出了一种全新的肝癌治疗策略，他们研发并优化了一种mRNA肿瘤靶向纳米颗粒策略，以恢复p53基因的功能。该方法通过构建一种新型的靶向聚合物纳米粒子载体，该载体可以高效负载编码p53蛋白的mRNA，可以将外源性抑癌基因p53特异性地递送至肿瘤部位并成功恢复了p53的抑癌功能。该纳米体系在抑制p53缺失型肝细胞性肝癌的增殖的同时，还可以与免疫检查点阻断 (ICB) 联合应用，不仅能抑制肿瘤生长，而且能显著提高肝癌的抗肿瘤免疫应答。

mRNA-based基因修饰动物模型--小鼠

基因修饰小鼠是了解发育和疾病中基因功能的重要工具。突变小鼠通常通过插入诱变或基因靶向方法产生。在传统的基因靶向方法中，突变是通过小鼠胚胎干 (ES) 细胞中的同源重组引入的。生产基因敲除小鼠既昂贵又耗时， 此外在大多数其他哺乳动物物种中，没有可用的已建立的 ES 细胞系可以有效地促进嵌合动物，这极大地限制了许多物种的遗传研究。在Cell的一篇经典文章“One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering”里，MIT张锋实验室在证明 CRISPR/Cas 介导的基因编辑允许高效地同时破坏小鼠胚胎干 (ES) 细胞中的五个基因（Tet1、2、3、Sry、Uty - 8 等位基因）。作者体外合成靶向 Tet1 和 Tet2 的 Cas9 mRNA (mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA kit, Invitrogen)，和sgRNA (MEGAshortscript T7 kit, Invitrogen)共注射到受精卵中，产生的小鼠在两个基因中都具有双等位基因突变，效率为 80%。最后，我们展示了 Cas9 mRNA/sgRNA 与突变寡核苷酸的共注射在两个靶基因中同时产生了定点突变。因此，CRISPR/Cas 系统允许一步生成携带多个基因突变的动物，这种方法将极大地加速功能冗余基因和上位基因相互作用的体内研究。

mRNA-based基因修饰动物模型--斑马鱼

鼠类虽带动了现代高等遗传学特别是基因转移方面的发展, 但其胚胎深埋于母体子宫中而无法进行胚胎学观察。因此，具有繁育力强、体外产卵、体外受精且胚体透明等生殖特性的斑马鱼成为遗传学和发育生物学研究的模式动物。另一方面，CRISPR/Cas 介导的基因编辑近些年的火热程度不用多说。Nature Biotechnology上的一篇文章“Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system”将经典与潮流结合，介绍了基因修饰斑马鱼模型构建的方法论。作者将Cas9 mRNA (mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit, Invitrogen) 和sgRNA (MAXIscript T7 Kit, Invitrogen) 显微注射到斑马鱼胚胎中来完成基因组编辑。为了优化基因组编辑所需的Cas9 mRNA和sgRNA 用量，研究者将不同浓度的 fh 靶向 gRNA 和Cas9 mRNA 显微注射到单细胞期斑马鱼胚胎中，然后使用 T7 核酸内切酶 I（T7EI）评估单个胚胎中等位基因突变的频率。几乎在所有测试的 RNA 浓度和单个胚胎中，作者都观察到了靶向插入/缺失突变（indels）。同时，作者发现当注射含有 12.5 ng/µl RNA 和 300 ng/µl Cas9 编码 mRNA 的溶液时，基因编辑频率最高。

mRNA-based基因修饰动物模型--果蝇

睡眠对动物很重要，并且受昼夜节律和稳态过程的调节。虽然对昼夜节律的分子机制研究取得了重大进展，但对睡眠的稳态调节知之甚少。十多年来，果蝇一直被用作睡眠机制研究的模型。虽然有研究表明NMDAR (N-甲基-D-天冬氨酸受体) 和D-Ser参与果蝇和哺乳动物的睡眠调节，但其分子机制并未被阐明。在Nature Communications的一篇文章 “D-Serine made by serine racemase in Drosophila intestine plays a physiological role in sleep”里，饶毅课题组发现D-Ser 合成缺陷(shmt- and srko)或NMDAR1表达沉默(nmdar1ko)的果蝇突变体睡眠减少，但 D-Ser 降解缺陷 (daao-dko) 会增加果蝇的睡眠。而D-Ser回补可使缺乏丝氨酸消旋酶 (SR, D-Ser合成关键酶 ) 的果蝇 (srko flies) 恢复表型。特别的，将 SR 重新引入特定的肠上皮细胞可以恢复 srko 突变体的睡眠。值得注意的是，本研究中所有果蝇突变体，均是通过把体外转录的Cas9 mRNA (MMESSAGE MMACHINE SP6 KIT, Invitrogen) 和对应sgRNAs显微注射到果蝇胚胎中得到。

小编总结

由此可见，不论是新兴的mRNA疫苗和肿瘤靶向治疗研究，还是技术成熟的基因修饰动物模型构建，体外转录可以说是mRNA研究中的经典步骤，而mMessage mMachine体外转录试剂盒更是mRNA研究的经典选择。1989 年在 Ambion（现称为 Invitrogen）的领导下， mMessage mMachine 和 MEGAscript成为全球第一款商业化的体外转录试剂盒。虽然品牌不断发展，但质量和卓越的结果保持不变。这些试剂盒被引用超过 50,000 次，被公认为业内最可靠和高性能的mRNA体外合成解决方案，经典选择，帮助您赢在起点！

References:

1. Richner, Justin M., et al. "Modified mRNA vaccines protect against Zika virus infection." Cell 168.6 (2017): 1114-1125.

2.  Richner, Justin M., et al. "Vaccine mediated protection against Zika virus-induced congenital disease." Cell 170.2 (2017): 273-283.

3. Xiao, Yuling, et al. "Combining p53 mRNA nanotherapy with immune checkpoint blockade reprograms the immune microenvironment for effective cancer therapy." Nature communications 13.1 (2022): 1-14.

4. Wang, Haoyi, et al. "One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering." Cell 153.4 (2013): 910-918.

5. Hwang, Woong Y., et al. "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system." Nature biotechnology 31.3 (2013): 227-229.

6. Dai, Xihuimin, et al. "D-Serine made by serine racemase in Drosophila intestine plays a physiological role in sleep." Nature communications 10.1 (2019): 1-11.