凯莱英自研究蛋白质工程改造转氨酶，催化合成关键中间体

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近日，凯莱英医药集团（股票代码：002821.SZ/6821.HK，以下简称“凯莱英”）在美国化学会学术期刊《Org. Process Res. Dev.》上刊发论文《设计用于高效合成Rimegepant关键中间体的转氨酶》（Engineering a Transaminase for Efficient Synthesis of Rimegepant Key Intermediate）。生物合成技术研发中心（CBST）酶进化团队采用新颖的酶改造策略，实现了酶活性从无到有、从有到优的大幅度升级，首次实现了通过生物酶催化合成治疗偏头痛药物Rimegepant的关键中间体，具有里程碑式的意义。该项研究结果由凯莱英独立完成，是凯莱英在工程酶领域取得的又一突破性进展，彰显了公司在该领域的卓越实力和领先地位。

降钙素基因相关肽（CGRP）是治疗和预防偏头痛最有前途的靶点之一，CGRP是由37个氨基酸组成的神经肽，是神经源性炎症的介质之一。CGRP类药物整体市场预计可从2019年的6.39亿美元增加到2026年的62.95亿美元，有望成为偏头疼治疗领域增长的主要推动力。Rimegepant是一款口服CGRP受体拮抗剂，在2020年2月获得FDA批准用于治疗急性偏头痛，显示出良好的安全性和有效性。

目前，Rimegepant关键手性中间体1的生产过程涉及过渡金属催化剂催化的两步高压还原氨化反应，（图1）。反应中使用的金属催化剂成本高昂，且两步反应收率仅有55%。

图1.化合物1的生产路径

转氨酶一步催化酮的转氨反应生成相应的手性胺，是目前制药工业中应用广泛的制备方法。

图2.化合2的酶胺化反应

凯莱英生物合成技术研发中心（CBST）在此领域深耕多年，建立了种类丰富的转氨酶酶库，可针对不同类型的底物进行快而准的高通量筛选，已经成功完成了数十个转氨酶的筛选以及工业应用案例。研究人员首先以化合物2为底物对超过300个转氨酶进行了筛选（图 2），然而没有筛选到有明显活性的酶。这个结果并不出人意料，化合物2在其潜手性羰基的两侧紧邻两个空间位阻都比较大的芳香基团，由于转氨酶自身的结构特点，这类分子很难被转氨酶转化是一个普遍的共识。另外，尽管定向进化是提高酶效率的常用手段，对于没有初始活性酶的改造仍然是一个巨大的挑战。

面对这样的挑战，凯莱英研究团队首先使用了“substrate walking”的策略（图3），利用空间位阻较小的底物类似物作为底物，以使转氨酶的活性向所需目标底物方向进化。正如研究团队预期，在经过两轮进化之后，成功获得了对目标底物有0.02%转化的突变体，实现了酶活性的“从无到有”，打开了“从0到1”的局面。

图3.以化合物4为底物的“Substrate walking”

鉴于转氨酶结合口袋附近的“柔性”loop在底物识别和酶活性中起着关键作用，研究人员通过对获得的突变体三维结构进行分析，在底物通道位置识别出一段关键的“柔性”loop区（图4）。通过对组成这段loop的氨基酸残基进行迭代饱和突变（ISM, iterative saturation mutagenesis）, 获得了一个活性提高450倍的突变体。之后，为了进一步提高酶活，研究人员采用了定向进化的策略，构建了大量的高质量文库，并利用凯莱英的高通量筛选平台对文库进行筛选，得到1个活性提高近50000倍的突变体，实现了酶活“从有到优”的飞跃式升级。

图4.83-91 loop的位置

研究人员使用最优突变体，对反应条件进行了优化，其中反应温度的影响较大，将反应温度由60℃降至45℃，最终转化率也由92%提高至99%以上。随后，研究人员进行了公斤级的放大，并建立了高效的反应后处理工艺，最终产品的分离收率达到80.2%，de值99.5%、纯度99.9%。显示出了酶法合成Rimegepant关键中间体的工业应用潜力。

图5.反应温度优化

凯莱英生物合成技术研发中心（CBST）团队通过酶进化获得可以高效合成Rimegepant关键中间体的转氨酶突变体，并利用酶法工艺实现了Rimegepant关键手性中间体的公斤级制备。与现有工艺相比，新的酶法工艺大幅提高了收率，避免了贵金属催化剂的使用，降低了有机溶剂的使用，反应可以在常温常压下进行，降低了生产成本和三废排放，更加安全环保。此项成果再次彰显了凯莱英在酶工程领域的技术实力和规模化应用水平。

长期以来，凯莱英作为全球范围内工程酶开发及商业化应用领域的领先者，持续深耕绿色制药技术，不断提升研发与规模化放大生产平台的能力和效率，强化服务客户的能力。生物合成技术研发中心（CBST）拥有专业的研发和生产团队，并搭建起先进成熟的酶筛选、进化平台。迄今已为全球众多客户提供从酶库筛选、酶进化、酶的发酵再到产业化生产的全方位服务，成功实现了许多重要药物原料关键中间体的酶催化生产，在相应领域拥有多项自主创新技术。

未来，凯莱英将不懈开发和推广先进的绿色可持续性酶法解决方案，为客户创造更大价值。让酶工程等先进绿色制药技术走出实验室，应用于规模化生产之中，创造价值、造福患者。