在产前诊断里应用数字PCR，太舒适了 | 专家述评

数字PCR（digital polymerase chain reaction, dPCR），因其不需要标准稀释曲线和反应效率，具有高灵敏度、高准确度以及绝对定量的优势。不但在遗传疾病、病原检测、致癌基因的分子诊断和法医学鉴定等诸多领域中意义重大，还在如无创产前基因诊断、胎儿非整倍体疾病、单基因疾病、胎儿性别检测等产前诊断领域发挥着重要作用，本文将介绍数字PCR在这些领域的应用。 

（ 作者：张彤 孙娅男 魏凤香 ）

1 无创产前基因诊断 dPCR已被用于识别罕见的基因变异以及与儿科发病疾病相关的多个基因拷贝数的差异中。 据报道，脊髓肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常见的常染色体隐性遗传病，是婴儿死亡的第二大常见原因，该疾病由生存运动神经元1基因(SMN1)缺失引起，导致肢体无力、吞咽困难和呼吸异常。目前常用的检测方法是通过绒毛穿刺（孕龄10-12周）或羊水穿刺（孕龄16-18周）的介入性产前诊断的方法来确认胎儿健康状况，但该方法具有一定的流产风险。目前，有研究表明 使用dPCR可准确定量SMN1和SMN2拷贝数以及弥补介入性产前诊断方法的缺陷 ，这对于正确诊断SMA和鉴别携带者是至关重要的，并且，这种快速的分子诊断方法适用于孕前优生检查、产前检测以及新生儿筛查，帮助医生或遗传顾问改善人群SMA发病率。 目前，基于微液滴dPCR检测方法 可从母体血浆中提取的未处理的游离DNA中识别胎儿地中海贫血状态 。在检测活检的卵裂球样品中的α-珠蛋白和SEA型缺失等位基因中明确报道，该高灵敏度方法可以为体外受精临床机构的α-地中海贫血的常规诊断提供可靠的技术收段，并减少血红蛋白巴特胎儿水肿综合征的发生。

2 胎儿非整倍体疾病 产前13、18、21、X、Y染色体拷贝数畸变占临床显著染色体畸变的80%以上。目前，可使用通用锁定核酸探针可靠地鉴定胎儿非整倍体，或也通过整倍体和非整倍体样本分布的差异，高精度地确定目标染色体的倍性。使用一种有前景的实验室常规检测方法——基于芯片的dPCR技术进行胎儿非整倍体的准确和快速测定，不仅 提供了最短的操作时间，还减少了分析时间、成本效益和提高了绝对定量的精度 。 其中，采用dPCR系统无创产前筛查（Non-invasive prenatal screening，NIPS）21三体综合征比采用NGS的相对便宜、所需时间短、成本低，具有广泛的适用性，更为重要的是与核苷酸序列信息获取方面的伦理问题相兼容，该方法有可能成为提高产前诊断准确性和可靠性的基础技术。

3 单基因疾病 微液滴dPCR （ddPCR）是检测母体血浆中胎儿游离DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）的常用工具。 cffDNA可在妊娠4周时在母体循环中检测到，游离胎儿DNA水平在5%到20%之间。 细胞游离DNA (Cell-free DNA，cfDNA)可以从母体血液样本中提取，cfDNA分析可以在怀孕早期为广泛的单基因疾病提供明确诊断。如在苯丙酮尿(PKU)无创产前诊断方法中，准确定量PKU家系孕妇血浆中cffDNA，计算胎儿DNA在总cfDNA中的浓度，并对胎儿DNA进行基因分型，是一种可靠的无创产前诊断PKU工具，并对cfDNA具有较高敏感性和特异性。 目前，应用ddPCR方法来预测母体遗传性单基因疾病的胎儿基因型。在检测无创胎儿人类血小板抗原（human platelet antigens，HPA）基因分型时被认为是一种安全可靠的方法，可早期诊断胎儿血小板不相容性，并可用于血小板免疫实验室的常规临床检测。对于单基因糖尿病孕妇巨大儿风险管理中，该方法具有潜在的适用性，并且通过 非侵入性检测 方法，消除了与侵入性羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样相关的流产风险或其他并发症。

4 X连锁遗传疾病 胎儿性别诊断可以通过羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样术等侵入性程序获得，但这些程序有1%的流产风险。目前，无创细胞游离DNA分子分析已成为监测器官移植或检测胎儿DNA的一种敏感生物标志物。可采用SRY基因靶点设计的ddPCR方法分析孕妇血浆中cffDNA来早期诊断(7周前)胎儿性别，对有如杜氏肌营养不良、肾上腺发育不良、血友病等x连锁疾病风险的家庭而言意义重大。 

原文以 《 数字PCR在产前诊断中的应用价值与发展趋势》 为 题 发表在《临床实验室》杂志2022年3月刊专题“POCT分子诊断”专家论坛版块