孙超主任团队：阻断肝细胞胆汁酸摄取改善对乙酰氨基酚诱导的肝毒性

2019年肝病领域顶刊JOH指出，世界范围内每年大约有200万例患者死于肝脏疾病，我国约有700万肝硬化患者，每年新发肝癌46万，乙丙肝感染者逾1亿，为社会带来沉重的医疗和经济负担。

为契合《“健康中国2030”规划纲要》中提出的将重大慢性疾病过早死亡率较2015年下降30%的目标，肝胆相照平台与天津医科大学总医院消化内科联合打造“肝研撷萃”精品栏目。

“肝研撷萃”由天津医科大学总医院孙超主任担任总编辑，范晓飞博士、惠洋洋博士、王晓雨博士、崔膑心博士任执行编辑，通过研读分享各种肝脏疾病诊断、治疗、预防和发病机制的前沿进展，结合团队自身的工作，为广大医生提供精进学术、助力临床的交流平台。

“肝研撷萃”第三期，孙超主任团队对近期发表于Journal of hepatology的一篇学术文章（Interruption of bile acid uptake by hepatocytes after acetaminophen overdose ameliorates hepatotoxicity）进行精品解读，以启迪临床。

对乙酰氨基酚（APAP）中毒是许多国家和地区急性肝衰竭的最常见原因之一。APAP在肝脏中主要经细胞色素P450代谢（Cyp2e1），形成蛋白质加合物导致氧化应激，激活细胞质中的c-JNK，诱导其转移至线粒体，进一步加剧氧化应激，最终导致细胞死亡。

目前针对APAP只有一种解毒剂，即N-乙酰半胱氨酸（NAC）被批准应用于临床。NAC的作用机制依赖于恢复肝细胞内的谷胱甘肽（GSH）水平，但只在中毒8小时内给药才能发挥最大作用。

既往认为APAP中毒导致的外周血胆汁酸（BA）浓度升高仅代表着肝功能受损，但进一步的研究认为其临床意义不止于此。

有学者提出：胆管中高浓度的BA提示血胆屏障受损，此外，肝细胞排泌BA功能亦受到影响。

本研究利用活体成像技术，能够在亚细胞水平完整捕获分析肝脏功能，特别是观察BA转运过程。结果提示：APAP导致肝细胞顶端膜的血胆屏障被破坏，而BA的无效循环造成肝细胞中产物积累、BA浓度升高，发挥毒性反应。

研究结果

BA浓度升高与APAP诱导的肝毒性相关

A-C：临床资料提示，APAP中毒导致的BA和转氨酶升高之间并无显著相关性，有的患者可在76小时外周血BA达到最大浓度。而临床观察到的高度异质性，可能正反映了处于中毒后不同时间点来就诊患者的生化指标异常；

D、E：在APAP诱导的小鼠肝中毒模型中，BA在造模2小时后即达到最大浓度。

BA浓度和转氨酶活性与APAP诱导的肝毒性相关

F：小鼠肝脏大体标本可见颗粒样改变提示组织损伤，APAP作用后4小时和8小时观察到肝小叶中央周围区细胞死亡；此外，在APAP作用后2小时仅有少量TUNEL阳性细胞出现；此后，Cyp2e1阳性区域TUNEL阳性细胞数量明显增加；

G：相比之下，cleaved caspase-3在损伤早期并未增加。

APAP中毒后毛细胆管形态改变

A、B：毛细胆管的直径明显扩张，且仅发生在肝小叶中央周围区，而不在汇管周围区；

C-E：毛细胆管改变和肝小叶中央周围区肝细胞中CLF（BA类似物，图中绿色荧光所示）的聚积先于细胞死亡；APAP作用后的前3小时，毛细胆管改变和CLF聚积呈时间依赖性增加；

F-H：免疫染色提示在APAP作用后1~2小时，Cyp2e1阳性区毛细胆管明显扩张。

APAP中毒后早期血胆屏障受损

A：对照组中，CLF在几秒钟内经由血窦被肝细胞迅速摄取清除，随后分泌到毛细胆管；APAP作用后，肝细胞对CLF的摄取与对照组相似，并向毛细胆管分泌CLF；

B：CLF一旦分泌到毛细胆管，其信号也会增加，并在血窦和肝小叶中央周围区肝细胞中保持高信号；与对照组相比，APAP中毒小鼠CLF在分泌到毛细胆管后直接在肝小叶中央周围区聚积；

C-F：在APAP作用后2小时，牛磺胆酸（TCA）有强烈的短暂聚积，在肝小叶中央周围区比汇管周围区更明显，这与肝组织匀浆中BA的质谱分析结果一致；

G：ZO1和Claudin3的免疫染色均显示紧密连接形态发生明显改变，两个相邻肝细胞之间的间隙明显增大；

H-J：APAP破坏血胆屏障，从而导致高BA浓度的胆汁从毛细胆管渗漏到血窦，BA被运输到肝细胞，并再次分泌到毛细胆管。

谷胱甘肽耗竭与胆汁淤积的时空关系

A、B ：APAP过量给药后1-4小时GSH瞬时耗尽的情况；

C：在给药1小时后，APAP显著降低了肝小叶中央周围区的GSH含量，同时APAP-GSH加合物含量升高，而TCA不升高或仅略有升高；给药2小时后，GSH耗竭、APAP-GSH加合物升高的中央周围区TCA明显升高；

D-F：肝小叶中央周围区GSH耗竭与毛细胆管形态改变相符，出现在TCA聚积之前。

A、B：第二次采用BSO和DEM联合干预；与APAP相似，BSO/DEM处理也使GSH耗竭；

C、D：与APAP对肝小叶中央周围区GSH的消耗相比，TUNEL阳性肝细胞仅在BSO/DEM处理8小时后才显著增加，且与转氨酶活性的增加和非带状死亡细胞区一致；

E-H：与APAP一样，BSO/DEM处理后的毛细胆管形态受损。然而，BSO/DEM的干预并没有导致CLF从毛细胆管渗漏到肝血窦；

I-K：BA浓度在血液和肝脏组织中均未增加。

A：APAP处理后肝组织匀浆中氧化应激标志物4-HNE的水平比BSO/DEM处理后显著升高；

B：APAP过量后氧化应激主要出现在肝小叶中央周围区，而BSO/DEM处理后的氧化应激水平则显著降低；

C-E：APAP和BSO/DEM处理均增加了BA的流量和总分泌量，并且显著降低了胆汁中的GSH浓度。

阻断胆汁酸无效循环缓解肝毒性

A-D：使用Oatp敲除小鼠，APAP与Myrcludex B同时腹腔注射，24小时后观察肝损伤情况。从大体、肝小叶中央周围区细胞死亡程度和转氨酶水平可以证实，这种干预保护小鼠免受APAP诱导的肝毒性；

E-H：APAP给药前Oatp敲除小鼠和WT小鼠之间Cyp2e1表达没有差异；尽管Myrcludex B加上Oatp的缺失改善了APAP诱导的细胞死亡，但它们并不能阻止由于APAP过量而导致的毛细胆管和紧密连接结构损伤；

I-K：Myrcludex B+Oatp敲除极大地降低了肝组织中BA的浓度，而血液中BA浓度同步显著增加，证明了抑制BA摄取有效缓解了肝毒性。

研究结论

APAP过量会导致血胆屏障的破坏，而这一病生理改变可能出现在肝细胞广泛死亡前。研究结果认为，由于胆汁酸（BA）大量渗漏到血窦，虽经肝细胞摄取，但进入了无效循环。由于无效循环的存在，肝细胞中的BA浓度超过其在生理状态下的处理能力，达到细胞毒性阈值，并作为可能的机制进一步诱发和加剧细胞死亡。未来可将阻断肝细胞摄取BA，作为治疗APAP诱导肝毒性的有效手段。

主编点评 孙超主任

对乙酰氨基酚（APAP）中毒是许多国家和地区急性肝衰竭的常见原因之一。目前针对APAP只有一种解毒剂，即N-乙酰半胱氨酸（NAC）被批准应用于临床，但是N-乙酰半胱氨酸的作用机制依赖于恢复肝细胞内的谷胱甘肽水平，且只在中毒8小时内给药才能发挥最大作用。从临床医生的角度，对于这类药物性肝损伤患者，经常看到生化指标提示外周血胆汁酸（BA）和转氨酶水平的显著升高，但是这两者并未表现出明确的相关性。从基础研究的角度，有学者认为胆管中高浓度的BA提示血胆屏障受损，此外，肝细胞排泌BA功能亦受到影响。那么BA升高到底是APAP诱导肝毒性的直接原因还是继发结果？

本期分享的文章有以下亮点： 

1. 利用活体成像技术，在亚细胞结构水平完整捕获分析肝脏功能，特别是详细阐明了BA在毛细胆管-肝血窦-肝细胞之间的转运过程。结果提示：APAP过量导致肝细胞顶端膜的血胆屏障被破坏，而BA的无效循环造成肝细胞中胆汁淤积，高浓度的BA超过其在生理状态下的摄取结合能力，造成毒性损伤，继发细胞广泛死亡。

2. 解释了外周血BA升高可能是导致APAP诱导肝毒性的直接原因，这一长期困扰临床的问题。

3. 小鼠体内实验亦证实抑制BA的无效循环能够有效缓解APAP诱导的肝毒性，这一作用依赖于降低肝组织中毒性BA的浓度，并同步增加血液循环中BA的水平，而不依赖于对毛细胆管和紧密连接结构损伤的改善。

展望：

本研究提到在部分因APAP中毒所致急性肝损伤的患者中，外周血BA的升高能够持续到APAP摄入后3~4天，因此阻断BA的无效循环能够极大拓展治疗时间窗，但在世界范围内对于药物性肝损伤的诊断都是个难题，建立及时准确的监测机制或体系对于降低肝衰竭发生率和相关死亡率至关重要。

作者简介 惠洋洋

天津医科大学总医院消化内科主治医师。毕业于天津医科大学临床医学七年制专业，博士在读。参与国家自然科学基金及天津市科技支撑项目，获得天津医科大学总医院青年孵育基金。以第一作者身份在包括美国肝病研究协会（AASLD）官方刊物等SCI期刊发表论文7篇，单篇最高影响因子7.66，累计影响因子30余分。目前研究方向为慢性肝病与营养不良、衰弱、睡眠障碍之间的关系，以及消化道肿瘤的早诊早治。

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