快报 | 复苏因子薄层琼脂培养法快速检测胸腔积液结核分枝杆菌

背  景

结核病是世界上发病率和死亡率最高的传染病之一。根据世界卫生组织（WHO）报告，2020年估计有987万例新发患者和150万例死亡患者。中国位居第二，仅次于印度，每年有84.2万例新发结核病患者和3万例HIV阴性的结核病死亡者。在报告的700万例结核病患者中，15%为肺外结核，其中胸膜结核是仅次于淋巴结结核的第二大常见类型，特别是在结核病高负担地区，也是胸腔积液的最常见原因。 近日，Frontiers in Microbiology杂志发表了题为《Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis in Pleural Fluid Using Resuscitation-Promoting Factor-Based Thin Layer Agar Culture Method》的论文，该文的第一作者为杜凤娇和邢爱英，通讯作者为刘忠泉和张宗德。

结核性胸膜炎的确诊依据是从胸腔积液、痰或胸膜组织中检出结核分枝杆菌（MTB）。然而，由于疾病的自然少菌和（或）非复制潜伏菌的存在，降低了胸腔积液中MTB的生长潜力，使得传统微生物培养方法阳性率低、耗时长。如胸腔积液涂片阳性率低（0～5%）；改良罗氏培养的阳性率（24%～58%）虽有提高，但培养时间较长（4～8周）；虽然采用液体培养基（如BACTEC系统）可以提高阳性率（30%～70%）、缩短报告时间(约2周)，但昂贵的设备和试剂限制了其广泛应用。胸膜活检的阳性率达到69.6%～82%，但为有创性检查，有引发结核病播散和加重病情的风险，未被广泛应用。此外，如GeneXpert MTB/RIF等分子检测虽可在数小时内报告结果，但敏感度较低(22.7%～51.4%)，价格昂贵。因此，迫切需要一种快速、简单、可靠、廉价的结核性胸膜炎诊断方法。

宿主免疫系统能够使结核分枝杆菌转入非复制状态，需要外部重新刺激来启动生长。复苏促进因子(Rpfs) 作为细菌的细胞因子，最初可通过溶菌酶和肽聚糖水解酶作用在体内和体外促进非复制细菌的复苏生长。在结核分枝杆菌中发现了5种功能冗余的复苏因子样蛋白(RpfsA-E)，它们在皮摩尔级浓度就能有效的促进同源陈旧菌的复苏、生长。后来也在临床样本中初步证实了它们的复苏作用。尽管Rpfs对结核分枝杆菌的生长刺激作用的确切机制尚不清楚，但我们推测，胸腔积液中潜伏的结核分枝杆菌中加入Rpfs 可促进MTB复苏生长，提高培养的阳性率，缩短报告时间。此外，薄层琼脂(TLA)被描述为一种简单、快速、廉价的方法，可以通过显微镜观察菌落形态和在培养基中加入对硝基苯甲酸(PNB)来初步鉴定结核分枝杆菌，大多数关于TLA的研究来自发达国家或艾滋病       病毒高流行环境。因此，我们开展了一项前瞻性研究，评价基于复苏促进因子的TLA培养法在胸腔积液中快速检测结核分枝杆菌的效果。

研究设计与对象

1. 连续收集2016年7月至2018年11月期间在北京胸科医院收治的X线胸膜有积液证据，疑似胸膜结核的患者。收集所有患者至少100 ml胸腔积液，进行抗酸杆菌(AFB)染色，在Rpfs-TLA、TLA和罗氏培养基上培养，并按照推荐的程序进行鉴定。随访至少3个月，收集常规胸膜活检标本或胸腔积液的临床、生化、分子生物学和微生物学检查，胸膜活检标本的组织病理学检查，以及胸膜活检标本或痰液的AFB染色结果。排除既往有结核病病史和结核病接触史或在入组前2周以上接受过抗结核治疗的患者，研究对象的主要临床特征见表1。

2. 定义和诊断：患者被分为三组 ：(1)确诊的结核性胸膜炎组：临床标本(包括胸腔积液、痰液或胸膜活检组织)在病因学(包括细菌学和分子生物学)上显示结核分枝杆菌阳性，或活检或手术标本中存在干酪样肉芽肿。(2)疑似结核性胸膜炎组：不符合细菌学确诊依据，但根据临床表现、胸腔镜、影像学及入组后3个月随访结果，诊断为活动性结核性胸膜炎者。(3)其他疾病组：为确诊其他胸膜疾病，排除结核性胸膜炎，且既往无结核病史和结核接触史、也未经过放化疗和手术治疗者，设为对照组。

3. 样本采集及处理: 无菌抽取每例胸腔积液患者胸腔积液100 ml，室温3000×g离心20 min后，弃去上清液，留10 ml沉淀，用移液管加入10 ml4%(重量/体积)的氢氧化钠(NaOH)，轻轻吹匀，室温静置15 min去污、离心，立即弃去上清。将沉淀物重新悬浮于0.5 ml磷酸盐缓冲液中，将 0.1 ml处理过的样品接种于Rpfs-TLA、TLA、罗氏培养基和抗酸杆菌涂片进行培养。

4. MTB培养与检测：采用标准程序进行MTB培养和涂片镜检。将去污后重悬样品于罗氏培养基、7H11薄层琼脂和含结核分枝杆菌复苏因子B(Rvl009)和Rpf E(Rv2450c)各2 nmol/ml 的7H11薄层琼脂培养基进行培养。 每批试验同时设加无菌生理盐水100 μl的阴性对照和100 μl H37Rv标准株（ATCC 27294）的阳性对照作为质量控制。37 ℃培养箱培养，记录培养状态和阳性天数。所有阳性培养物均经萋-尼染色确认抗酸杆菌，刮取阳性培养物菌落研磨、煮沸后，提取DNA进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实目的条带为MTB，并测序进行菌种鉴定。

研究结果

1. 患者特点：前瞻性收集155例临床疑似结核性胸膜炎患者，剔除诊断不明确及资料不全者18例（3例资料不全，11例诊断不明，4例培养物污染），最终纳入HIV阴性的137例受试者(图1)。包括结核性胸膜炎103例 (其中确诊49例，疑似54例)，34例非结核性胸膜患者作为对照组，包括肺癌27例(腺癌21例，小细胞癌10例，鳞癌6例)，细菌性胸膜炎5例和胸膜间皮瘤2例。结核性胸膜炎组的年龄低于非结核性胸膜炎组（P<0.001）；腺苷脱氨酶活性、淋巴细胞计数、乳酸脱氢酶、C反应蛋白均高于对照组(P值均<0.05)（表1）。

2. 诊断性能评价：在103例结核性胸膜炎组中Rpfs-TLA的敏感度为43.69%，显著高于TLA（29.13% ）、罗氏培养（26.21%）和涂片（8.74%），差异有统计学意义（P值均<0.001）。TLA的敏感度略高于罗氏培养，但差异无统计学意义(P>0.05)。在34例对照组中四种方法的特异度均为100%(表2)。在49例确诊结核性胸膜炎组中，Rpfs-TLA、TLA和罗氏培养的敏感度分别为71.43%、61.22%和55.10%，三组间差异无统计学意义(P值均为>0.05)。

表 2. 不同方法对结核性胸膜炎的诊断效能评价

Rpfs-TLA从54例临床诊断结核性胸膜炎组中额外检测出10例阳性者，当将Rpfs-TLA结果纳入诊断标准时，结核性胸膜炎的确诊比例可由47.57%(49/103)提高到57.28%(59/103)。49 确诊结核性胸膜炎组中，Rpfs-TLA、TLA、罗氏培养和涂片的MTB检出例数分别为35例、30例、27例和9例（图2）。

3. 阳性结果平均报告时间：Rpfs-TLA、TLA和罗氏培养的阳性标本均萋-尼染色阳性，PCR产物测序均与H37Rv具有IS6110同源序列，证实为MTB。Rpfs-TLA的平均报告时间为(11.87±2.29)d，TLA为(21.60±3.33)d，罗氏培养为(36.41±4.02)d。Rpfs-TLA的培养时间显著低于TLA和罗氏培养(       F=16.72，       P<0.001)。TLAs的培养时间显著低于罗氏培养法，差异有统计学意义(       P<0.001)。 

4. MTB菌落形成单位数(CFUs)比较: Rpfs-TLA培养组的平均CFUs为(72.87±48.71)，显著高于TLA培养组(28.17±17.72)，差异有统计学意义（       F=16.72，       P<0.001）。

研究的意义及展望

      本研究依据前期实验结果从结核分枝杆菌5个Rpfs中选择在大肠埃希菌BL21中高表达、易于纯化，且复苏效果相当于5种Rpfs组合的Rpf B和Rpf E两种复苏因子蛋白添加到7H11薄层琼脂培养基中，并引进显微镜观察特征性微小菌落报告结果，建立了结核分枝杆菌Rpfs-TLA培养法。Rpfs-TLA检测胸腔积液MTB的阳性率显著高于TLA（29.13%）、罗氏培养（26.21%）和涂片（8.74%）（P值均<0.001），且Rpfs-TLA的平均菌落形成单位数显著高于TLA (P<0.001)。Rpfs-TLA检测胸腔积液MTB的平均报告时间为11.87d，显著少于TLA的21.60d、罗氏培养的36.41d（P值均<0.001）。此外，Rpfs-TLA从54例临床诊断结核性胸膜炎组中额外检测出10例阳性者，当将Rpfs-TLA结果纳入诊断标准时，结核性胸膜炎的确诊比例可由47.57%(49/103)提高到57.28%(59/103)，提示Rpf可在一定程度上恢复胸腔积液中休眠和(或)持留MTB的生长活力，促进MTB生长，提高阳性率。总之，Rpfs-TLA具有可靠、快速、廉价、简便的优点，能够为结核性胸膜炎的鉴别、诊断提供帮助。 

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