草酸钙晶体诱导肾损伤机理的蛋白质组学与代谢组学综合策略

草酸钙晶体诱导肾损伤机理的蛋白质组学与代谢组学综合策略

肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应，是慢性肾脏疾病（CKD）进展为终末期肾功能衰竭的重要过程。肾结石是最常见的肾脏疾病之一，伴有腰腹痛、血尿、尿路感染等临床症状，可增加肾纤维化的风险。草酸盐晶体诱导的肾损伤是肾结石的早期阶段;探索肾结石防治机制具有重要意义。本研究采用草酸钙（CaOx）晶体诱导肾损伤的啮齿动物模型，采用蛋白质组学和代谢组学相结合的网络分析方法，揭示晶体肾损伤的机理，为肾结石的干预提供潜在靶点。使用基于UHPLC-Q/TOF-MS平台的代谢组学方法和iTRAQ定量蛋白质组学方法，我们从肾脏组织中筛选出244种代谢物和886种蛋白质，与对照组相比，晶体组有显著变化。然后，应用独创性途径分析（IPA）通过关联和整合差异代谢物和蛋白质来构建蛋白质到代谢调节网络。结果表明，CaOx晶体可通过Akt、ERK1/2和P38 MAPK途径诱导炎症反应和氧化应激，影响氨基酸代谢和脂肪酸β氧化导致肾损伤，为肾结石的早期防治提供了重要指导。

介绍

肾结石是泌尿科中最常见的疾病之一，伴有腰腹痛、血尿、尿路感染等临床症状，增加患慢性肾脏病（CKD）、肾纤维化、冠心病、卒中的风险（ 1-3 ）。肾纤维化是肾脏对慢性损伤的病理修复反应，是CKD进展为终末期肾功能衰竭的重要过程（ 4 ）。肾结石和肾纤维化往往会持续多年，因此很难在肾功能严重受损甚至失败发生之前识别疾病进展。而且，在现阶段，无论是肾结石还是肾纤维化，其发病机制尚未明确。因此，迫切需要加强对肾结石和肾纤维化机制的研究。 近年来，随着高通量技术的飞速发展，蛋白质组学和代谢组学已被广泛用于研究肾脏疾病（ 5-7 ）的机制，如CKD、急性肾损伤和糖尿病肾病。蛋白质组学主要关注蛋白质，而代谢组学则专注于下游小分子代谢物。蛋白质和代谢物是连接基因型和表型的重要中间分子。蛋白质组学和代谢组学的组合网络分析是探索基因表型潜在机制的有效工具（ 8 ）。Wettersten等人利用蛋白质组学和代谢组学技术对人肾细胞癌组织进行了广泛的分析，发现肾细胞癌细胞中谷胱甘肽通路上调，β氧化通路受到抑制，为开发肾癌抗代谢治疗策略提供了坚实的理论依据（ 9 ）。 肾结石因其患病率高、复发率高，影响患者的生活质量，加重人们的经济负担。目前，肾结石病的研究主要集中在结石形成的机理（ 10 ， 11 ），早期诊断技术（ 12 ， 13 ），治疗策略（ 14 ， 15 ）等。由于肾结石形成机制的复杂性，对肾结石的发病机制仍没有统一的结论。在这项研究中，我们专注于蛋白质组学和代谢组学的综合分析策略，而不是单一蛋白质组学（ 16 ）或代谢组学（ 17 ），以分析肾结石小鼠在许多方面的内部变化，从而克服单组学的局限性，旨在进一步揭示肾结石小鼠代谢调节网络的变化。

材料和方法

化学品和试剂

乙醛酸（50%在水中）是从TCI（日本东京）购买的。iTRAQ 套件购自 AB SCIEX（美国加利福尼亚州福斯特城 113 号）。甲醇和乙腈从默克（德国达姆施塔特）购买。使用Milli-Q水净化系统制备超纯水（Millipore Corp.，Billerica，MA，USA）。甲酸，甲酸铵和2-氯-L-苯丙氨酸从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得。

动物实验和样本采集

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）实验动物护理和使用指南进行。从上海SLAC实验动物有限公司（中国上海）购买了约40只野生型雄性C57BL / 6小鼠（7-8周）。有条件住房1周后，将这些小鼠随机分为对照组和Crystal组，每组20只小鼠。所有老鼠都可以自由获得食物和水。将Crystal组的小鼠以120mg / kg的剂量每天一次注射乙醛酸盐，持续5天，对照组中的小鼠注射相同体积的盐水。在动物实验结束时，从所有小鼠的眼球中抽取血液，然后在原位有氧灌注后收获所有肾脏。将每组的三个肾组织固定在4%多聚甲醛中以进行进一步的组织学分析;其他的则立即储存在-80°C。在4°C下保持相同2小时后，将血液以3，500rpm离心15分钟，然后在-80°C下收集血清。

组织学和生物化学分析

将固定组织加工用于石蜡包埋，并制备3-4μm切片并用Von Kossa染色。使用显微镜观察皮质和延髓交界处的肾钙沉积。使用迈瑞生化分析仪BS-380（中国广东）测定血清肌酐和尿素氮含量。采用比色法测定试剂盒测定新鲜肾组织中的钙含量，使用南京建城（中国江苏）的商业试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Sod）和丙二醛（MDA）的活性。使用从南京建成（中国江苏）购买的ELISA试剂盒测定白细胞介素-6（Il-6），白细胞介素-10（Il-10），白细胞介素-1β（Il-1β），肿瘤坏死因子α（Tnf-α），细胞间细胞粘附分子（Icam）和血管细胞粘附分子（Vcam）的水平。使用Beyotime Biotechnology（中国江苏）的DAB检测试剂盒对肾脏切片进行靶蛋白的免疫组织化学染色。所有一抗均来自Proteintech集团（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。

代谢组学分析

每组8个肾组织用于代谢组学分析。称取冷冻组织，然后用含有4μg/ ml 2-氯-L-苯丙氨酸作为内标的1.5ml 80%甲醇溶液匀浆2分钟。然后，将匀浆在4°C下以13，000rpm离心15分钟。将上清液转移到注射小瓶中，并与10μl等分试样上清液混合作为质量控制（QC）样品。 安捷伦 1290 Infinity LC 系统配备了安捷伦 6538 精确质量四极杆飞行时间质谱仪（UHPLC-Q/TOF-MS），使用沃特世 XBridge BEH 酰胺色谱柱（2.5 μm，100 × 2.1 mm，沃特世，米尔福德，美国）和沃特世 XBridge BEH C18 色谱柱（2.5 μm，100 × 2.1 mm，沃特世，米尔福德， 马萨诸塞州，美国）。酰胺柱的流动相由含有0.1%甲酸和10mM甲酸铵（A相）的水溶液以及含有0.1%甲酸的乙腈溶液（B相）组成。洗脱条件为0–1 min， 95%B;1–3 分钟， 95–85%B;3–13 分钟， 85–60%B;并且用于平衡系统的后置时间为5分钟。流量设定为0.4毫升/分钟;柱温设定为25°C;并且注射体积为4μl。C18柱的流动相为0.1%甲酸（A相）和乙腈，用0.1%甲酸（B相）修饰。洗脱条件为0–2 min， 2%B;2–10 分钟， 2–66%B;10–17 分钟， 66–98%B;17–19 分钟， 98%B;后期时间为5分钟。流量设定为0.4毫升/分钟;柱温设定为25°C;注射体积为2μl。大量数据是在ESI和ESI中获取的+−质量范围从 50 到 1，100 Da 的模式。正模毛细管电压为4 kV，负模为3.5 kV，气体温度为350°C，碎片电压为120 V。MS/MS的碰撞能量范围为10至40 eV。 采用上述UHPLC-Q/TOF-MS方法对组织样品进行分析，将QC样品均匀插入序列中，评价体系的稳定性。 海量数据的预处理基于我们之前报道的方法（ 18 ）。开源 R 软件包 XCMS 用于峰值提取、对齐和集成。然后，使用SIMCA-P软件（版本11.0，Umetrics，Umea，Sweden）分析这些变量，进行多变量统计分析，以评估UHPLC-Q / TOF-MS系统的稳定性。代谢注释基于将汇总QC样本上的代谢组学分析和MS / MS频谱图获得的准确m / z值与Metlin数据库中的条目（ https://metlin.scripps.edu/ ）相匹配。根据MS / MS频谱图鉴定的代谢物被准确注释，并且仅基于m / z值（MS）鉴定的代谢物被假定注释。在代谢注释之后，使用安捷伦MassHunter Profinder B.06.00检查和量化所有已鉴定的峰。在一种以上的液相色谱-质谱（LC-MS）方法中报告了一些代谢物，其中选择了QC样品的良好峰形和最小的方差系数。

iTRAQ 定量蛋白质组学分析

基于我们之前的方案，将来自每组不同小鼠的9个冷冻肾组织用于iTRAQ定量蛋白质组学分析（19）。随机地，每组的三个组织作为新样本汇集在一起。从混合样品中提取蛋白质，纯化，然后使用BCA蛋白质定量试剂盒进行定量。使用iTRAQ缓冲液试剂盒中的还原试剂和半胱氨酸封闭试剂还原和烷化来自每个混合样品的约100μg蛋白质，并使用测序级胰蛋白酶[1：50（w：w））水解成肽]，然后，根据制造商的手册，在iTRAQ试剂盒中用等压标签标记胰蛋白肽， 对照组中的样本被113，115，117个标签标记，Crystal组中的样本被114，116，118个标签标记。将标记的肽混合在一起，然后使用安捷伦ZORBAX 300Extend-C18柱（5μm，4.6×250 mm）通过高pH反相液相色谱（pH = 10）进行分馏。将洗脱液合并为10个馏分，在Eksigent纳米LC-Ultra上进行分析 断续器系统串联 TripleTOF 5600 （AB SCIEX， CA， USA）.将约3μl样品以3μl/min的速度加载到纳米LC捕获柱（ChromXP C18CL，3μm，350μm×0.5mm）中，使用溶剂A（2%ACN和0.1%甲酸溶液）和溶剂B（ACN溶液与溶剂B）在30°C下使用溶剂A（2%ACN和0.1%甲酸溶液）用纳米分析柱（ChromXP C18CL，3μm，75μm×150mm）分离2%水和0.1%甲酸），速率为300 nl / min，90分钟梯度洗脱为0-0.1分钟，5-10%B;0.1–60 分钟， 10–28%B;60–75 分钟， 28–50%B;75–75.5 分钟， 50–80%B;75.5–80分钟， 80%B;80–80.5 分钟， 80–5%B;和 80.5–90 分钟，5% B。在ESI模式下收集质量数据，MS范围为350-1，250 Da，MS / MS范围为100-1，500 Da。每个周期最多选择40个前体进行碎片化，使用滚动碰撞能量，动态排除18秒，碎片的电荷设置为+2至+5。++ MASCOT蒸馏器软件（版本2.6）提取质谱，并去除同位素。然后，在基于Mascot（Matrix Science，伦敦，英国;版本2.6.0）从Uniprot下载的蛋白质数据库中搜索所有MS / MS光谱。支架（版本Scaffold_4.8.2，Proteome Software，Inc.，波特兰，俄勒冈州，美国）用于鉴定肽和蛋白质。具有支架的肽局部FDR为<1%被认为是可信的，具有两种独特肽的蛋白质被认为是可信的。支架Q+（版本Scaffold_4.8.2，Proteome Software，Inc.，波特兰，俄勒冈州，美国）用于肽和蛋白质的定量。采用曼-惠特尼检验和本杰明-霍奇伯格调整分析两组之间的差异。

代谢物和蛋白质的集成独创性途径分析

使用独创性途径分析（IPA）软件（Qiagen，Redwood City，CA，USA）分析了定量的差异蛋白和代谢物。将包含差异表达蛋白和代谢物ID、折叠变化值和p值的数据集上传到IPA进行核心分析，其中可以进行与草酸钙（CaOx）晶体诱导肾损伤相关的规范途径、疾病和功能、上游调节因子分析、毒性分析和网络分析。规范通路显示整个数据集中最重要的相关规范通路（代谢通路和信号通路）。对疾病和功能的分析检查数据集中已知影响疾病和功能的分子，将分子的变化方向与文献中得出的期望进行比较，然后根据变化方向对每种疾病和功能进行预测。IPA上游调节剂分析用于识别上游调节剂，并根据上游调节剂和靶标之间的预期因果效应预测它们是否被激活或抑制，给定在数据集中观察到的分子变化。毒素列表是已知参与特定类型毒性的分子列表。IPA-Tox分析使用毒性功能与毒性列表相结合，将实验数据与临床病理终点联系起来，了解药理学反应，并支持作用机制和毒性假说的产生机制。网络分析模块分析具有共同功能的分子之间的相互作用，以构建网络。整个核心分析依赖于Ingenuity®知识库，该知识库由IPA内容科学家根据文献手工策划。IPA评分主要基于p和z得分的值，p的值基于右尾Fisher的精确测试算法计算，反映了实验中一组有意义的分子与已知过程/途径/转录之间的关联是否来自随机匹配。虽然 z 得分算法旨在降低随机数据生成重要预测的可能性。如果分子/功能的z评分大于2，则通常被认为被显着激活，如果小于-2，则被认为被显着抑制。 转到(G)：

结果

组织学和生化分析

在皮质和延髓交界处对肾组织的Von Kossa染色显示晶体组（ 图1A、B ），晶体组肾钙含量显著高于对照组（ 图1C ).同时，乙醛酸盐注射（ 图 1D，E ).基于免疫组化染色，在草酸盐晶体诱导的肾损伤后，可检测到不同蛋白质的表达明显较高，包括Serpina3，Anxa3，Cd44，galectin-1（Lgals1），Krt8，Lcn2，Cd14和S100a4（补充图1）。

图 1 对照组和晶体组中肾脏钙和生化分析（n = 5）的Von Kossa染色部分（×400）（n = 3）。（A）用对照组的Von Kossa染色的肾切片，（B）用Crysal组的Von Kossa染色的肾脏切片，（C）对照组和Crystal组的肾钙含量，以及（D，E）对照组和Crystal组的血清肌酐和血氮水平。数据表示为SD±平均值，*p<与对照组相比为0.05，**p<与对照组相比为0.01。

代谢分析

使用上述UHPLC-Q/TOF-MS方法获得的组织样品和QC样品的代表性总离子色谱图（TIC）如图2所示。使用XCMS封装提取了约2，219（酰胺正位）、690（酰胺负）、1，559（C18负）和416（C18负性）特征。将特征导入SIMCA-P进行归一化后的多变量统计分析，然后采用无监督主成分分析（PCA）观察QC样品的聚集情况以及对照组与晶体组的分离趋势。如 PCA 评分图 （ 图 2 ），QC样本收集良好，晶体组与对照组明显分离。这些结果表明，该系统稳定，晶体组的代谢特征与对照组的代谢特征显着不同。按照上述方法对数据进行预处理后，鉴定并定量了368种代谢物。与对照组相比，晶体组有244个代谢物，变化超过1.3倍，FDR调整后的p值<0.05，上调119个代谢物，下调125个代谢物。不同的代谢物和蛋白质显示在补充材料中。

图 2 基于代谢物的对照组、晶体组和 QC 样品的主成分分析 （PCA） 评分图。（A） 使用酰胺列的 ESI 模式下的图，（B） ESI 模式下的图 +− 模式使用酰胺柱，（C）ESI模式下使用C18列的绘图，以及（D）ESI中的绘图 +− 模式使用 C18 列。

蛋白质组学分析

在这个iTRAQ实验中，我们总共鉴定了187，510个光谱和5，191个蛋白质。有886种蛋白质，显示晶体组和对照组之间有显着变化（折叠变化>1.3，调整后的p<0.05）。其中，与对照组相比，697种蛋白质上调，189种蛋白质下调。不同的蛋白质和代谢物显示在  补充材料  中。

代谢物和蛋白质的集成IPA

采用独创性途径分析，整合886种差异蛋白和244种差异代谢物进行核心分析。 图 3A 显示前 20 个显著失调的规范通路 （|z 得分> 2|）。整合素连接激酶（ILK）信号传导，Rho家族GTP酶的信号传导，整合素信号传导，急性期反应信号传导，使用rho调节基于肌动蛋白的运动，肌动蛋白细胞骨架信号传导，IL-8信号传导，RhoA信号传导，嘌呤核苷酸降解II（需氧），内在凝血酶原激活途径，肝纤维化信号通路，巨噬细胞中一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的产生，染色体复制的细胞周期控制， 瓜氨酸生物合成显著活化，缬氨酸降解、异亮氨酸降解、亮氨酸降解、脂肪酸β氧化（FAO）、RhoGDI信号传导和氧化磷酸化均显著抑制。

图 3 基于差异表达的蛋白质和代谢物的可信规范途径和疾病或功能注释（| z 得分>2|和  p  < 0.05）。 （A）  规范途径。 （二） 疾病或功能注释。橙色表示激活（ z  得分>2）;蓝色表示抑制（ z  评分< −2），较深的颜色表示更显著的激活或抑制。 与对照组相比，选择晶体组表达相差2倍或0.5倍的蛋白质和代谢物进行疾病和功能分析、毒性分析、上游分析和网络分析。根据疾病和功能分析，Crystal组的以下过程显着增加：细胞活化，白细胞结合，白细胞活化，吞噬细胞活化，抗原呈递细胞活化，单核白细胞活化，T淋巴细胞归巢，外渗，趋化和白细胞归巢，这些被归类为细胞间信号传导和相互作用，免疫细胞运输， 和炎症反应（ 图 3B ). 上游调节剂分析可以预测可以调节所提交分子变化的上游调节剂。Il6，Tnf，Osm，Il10，Il1B，Csf2，Nos2，Cebpa和Agt被确定为上游细胞因子，酶，转录调节剂或生长因子。数据集中的目标分子显示在 表 1 . 一个偏置项是数据集偏置和上游调节器偏置的乘积。当该项的绝对值为0.25或更高时，则上游监管机构的预测被认为是有偏差的（20）。此类行在“注释”列中标有“偏差”一词。 b定义重叠的p值以测量数据集中网络调节基因的富集，而不考虑调节方向。该计算基于单侧 Fisher 精确检验，该检验假设一个具有恒定基因数的随机数据集作为空模型 （20）。 毒性分析表明，Anxa3、Cd14、Cd44、Lcn2、Umod、Dpysl3、甲型肝炎病毒细胞受体1（Havcr1）、Hp、Serpina3和Lgals1是急性肾功能衰竭（AKI）、持续性肾缺血再灌注损伤、急性期反应蛋白阳性以及线粒体和线粒体膜跨膜电位升高（ 表 2 ).

表 2蛋白质和代谢物的毒性分析，显示晶体组和对照组之间的差异超过2倍。

独创性毒性列表

一个-log （p 值）

b率

分子

在单独的窗口中打开

一个–log（p 值）反映了差异表达的分子与毒性过程之间的关联是否来自随机匹配。b该比率显示了差异表达的分子与毒性列表中的总分子的重叠程度。

对显著差异表达的蛋白质和代谢物的网络分析显示在补充表1中（评分>20）。可信网络与免疫性疾病、炎症性疾病、炎症反应、脂质代谢、分子转运、小分子生化、氨基酸代谢和胃肠道疾病有关。得分最高的2个网络与免疫性疾病，炎症性疾病和炎症反应相关，并合并在一起。合并的最高分网络表明，Arg1，Basp1，Cd14，Havcr1，Hp，Lcn2，L-plastin （Lcp1），Marcks，Pacs1，Tpm1，Umod，Akr1b10，Aldh1a2，Cdkn2aipnl，冠蛋白1A（Coro1a），Krt20，Krt8，Loxl2，Rbm3，S100a4，乙酰-L-肉碱，柠檬酸，L-半胱氨酸，高枸杞碱，瓜氨酸，锎草酮（硫酸吲哚基硫酸盐），犬尿酸，磷酸胆碱，1，4-IP2和N-乙二醇基神经氨酸在晶体组中显着上调。这些分子通过Akt，ERK1 / 2，p38 MAPK和促炎细胞因子相互作用，分子活性预测因子（MAP）预测连接子被激活（图 4).

图 4 与免疫性疾病、炎症性疾病和炎症反应相关的顶级网络基于晶体组和对照组之间显著差异表达的蛋白质和代谢物。红色形状表示上调分子，绿色形状表示下调分子。预测图例在图例框中进行批注。

炎症和氧化应激相关分子的验证

根据通路分析、上游调节因子和网络分析，测定了肾组织中的炎症细胞因子、粘附分子和氧化应激指数，以表征炎症和氧化应激状态。肾组织中Il-6，Il-10，Il-1β，Tnf-α，Icam，Vcam，GSH-Px，Sod和MDA的水平或活性显示在 图 5 .

图 5 对照组和晶体组肾组织中白细胞介素-6（Il-6），白细胞介素-10（Il-10），白细胞介素-1β（Il-1β），肿瘤坏死因子α（Tnf-α），细胞间细胞粘附分子（Icam），血管细胞粘附分子（Vcam），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），超氧化物歧化酶（Sod）和丙二醛（MDA）的水平或活性（ n  = 5）。* p 与对照组相比<0.05，** p <与对照组相比为0.01。 与对照组相比，晶体组的促炎因子Il-6，Il-1和Tnf-α以及粘附分子Icam和Vcam的水平增加;并且抗炎因子Il10的水平降低，表明CaOx晶体可以诱导炎症反应。晶体组MDA水平升高，GSH-Px和Sod活性降低，表明CaOx晶体诱导氧化应激损伤。不幸的是，两组之间的Il-10，Tnf-α，GSH-Px和MDA的差异不显着，这可能是由于样本量小。

讨论

为明确肾结石疾病的发病机制，本研究对肾组织蛋白质组学和代谢组学进行了联合分析，相互验证和互补，从而更系统、更全面地分析了生物分子的功能和调节机制，为肾结石疾病的防治提供了理论支持。大多数肾结石部分或完全由CaOx组成（ 21 ），因此，在我们的研究中进行了由乙醛酸盐诱导的CaOx晶体肾损伤小鼠模型（ 22 ）。与对照组小鼠相比，晶体组小鼠的蛋白质和代谢物发生显著变化。IPA软件的规范通路分析表明，多种炎症相关通路（ILK信号传导，整合素信号传导，肌动蛋白细胞骨架信号传导，Rho家族GTP酶和RhoA信号传导以及IL-8信号传导），氧化应激（巨噬细胞中NO和ROS的产生，急性期反应信号传导）被显着激活;支链脂肪酸降解和FAO被显著下调。根据对疾病和功能的分析，与对照组相比，Crystal组的细胞间信号传导和相互作用，免疫细胞运输和炎症反应增加。根据网络分析，Cd14，Havcr1，Hp，Lcn2，Umod，Lcp1，Coro1a，Krt8，Loxl2和S100a4通过激活Akt，ERK1 / 2，p38 MAPK和促炎细胞因子相互调节并相互作用，并且与免疫性疾病，炎症性疾病和炎症反应有关。在这些网络节点中，Cd14，Lcn2，Umod，Havcr1和Hp负责AKI，持续性肾缺血再灌注损伤和阳性急性期反应蛋白。Cd14是一种促炎蛋白，作为Toll样受体的共受体参与先天免疫系统（23 ）。一项队列研究表明，肾功能不全患者的促炎性Cd14水平升高;这可能是因为炎症状态增加，导致肾功能不全的发展（24 ）。Cd44是一种普遍表达的跨膜糖蛋白，并且还调节促炎信号传导作为具有Toll样受体4和MD-2（的独特受体复合物25 ，26 ）。Havcr1，也称为T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1（TIM-1）或肾损伤分子（KIM-1），是TIM基因家族的成员，其广泛参与免疫细胞活性的调节（27 ，28 ）。对于各种形式的损伤，KIM-1 表达在近端肾小管上皮中明显上调 （29 –32 ）。KIM-1含有免疫球蛋白结构域和O-糖基化粘蛋白亚结构域（29 ）。该结构表明KIM-1是一种上皮细胞粘附分子，它可能参与术后肾中近端肾小管上皮细胞的表面粘附相互作用（30 ）。中性粒细胞明胶酶相关的脂质碱（Ngal，Lcn2），脂卡林家族的一种小蛋白质，通常被认为是急性肾损伤（的生物标志物33 ，34 ）。对肾脏的全基因组分析表明， Lcn2 是兰德尔斑块区域组织中顶部上调的基因，这被认为是肾结石形成的焦点（ 35  ）。Ngal在嗜中性粒细胞和上皮细胞中表达，与炎症和急性肾损伤有关（36 ）。Ngal在肾脏可能来自肾小管细胞和嗜中性粒细胞浸润肾脏（36 ，37 ）。Uromodulin，也称为Tamm-Horsfall蛋白，由Umad仅在肾上皮细胞中表达，并与估计的肾小球滤过率（eGFR）相关（38 ，39 ）。一些Umad风险变异可以增加尿路调蛋白表达，然后诱导盐敏感的高血压和肾损伤（40 ）。S100a4蛋白，几个S100超级家族，可以通过与免疫细胞上的特异性受体结合来增强炎症反应，以促进先天免疫，细胞分化，细胞死亡或炎症介质的分泌作为警报素（41 ，42 ）。Anxa3是膜联蛋白之一，它是Ca2 +依赖性磷脂结合蛋白（43 ），主要与磷脂酰乙醇胺相互作用。据报道，Anxa3的失调与癌症的发展和进展有关（44 ）。Serpina3属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（45 ）。此外，Serpina3在肾脏中的作用可能是平衡肾损伤后的炎症，氧化应激和肾纤维化（46 ）。角蛋白是上皮细胞细胞骨架的中间细丝，并以器官和上皮细胞特异性方式表达（47 ）。Krt8是II型角蛋白，在肾单位的所有上皮细胞中表达（48 ）。Krt8表达在肾小管损伤的不同模型中显着增加，并被认为是上皮细胞应激损伤的标志物（49 ，50 ）。Lgals1，一种碳水化合物结合蛋白，在RCC癌症组织中显着增加，并且与癌细胞增殖，侵袭有关（51 ，52 ）。据报道，Lgals1可以触发涉及线粒体膜电位增加的凋亡程序，并通过杀死抗肿瘤效应T细胞在肿瘤免疫逃逸中起关键作用（53 ）。最近的一项研究表明，Lgals1在大鼠模型和CKD人群中的肾小球中持续高度表达，并与eGFR呈显着负相关，这表明Lgals1可能在肾小球的损伤过程中具有关键作用（54 ）。 值得注意的是，几种色氨酸代谢物，硫酸吲哚氧基酯，犬尿酸和黄嘌呤酸在Crystal组中显示出接近或超过10倍的增加。大多数色氨酸通过犬尿氨酸代谢途径代谢，犬尿酸和黄嘌呤酸是犬尿氨酸代谢途径的代谢产物。色氨酸也被细菌色氨酸酶代谢以产生前体吲哚，然后其中一些被CYP2E1转化为硫酸吲哚醇和磺基转移酶主要在肝脏中（ 55 ）.硫酸吲哚基酯是一种尿毒症毒素，显示受损肾脏显着增加（ 56 ）。最近，许多报道表明色氨酸的肠道代谢物激活芳烃受体（AHR）信号通路（ 57 ， 58 ），其可诱导氧化应激和炎症（ 59 ）并介导肾纤维化（ 60 ）。马尿酸是一种肠道来源的尿毒症毒素（ 61 ），在晶体组中也显着增加（5.881倍）。膳食多酚通过多种酚类反应途径使用结肠细菌转化为苯甲酸，然后通过甘氨酸-N-酰基转移酶（GLYAT）与甘氨酸结合，在肝脏或肾脏中产生马尿酸（ 62 ）。一项研究表明，积累的马尿酸可以通过诱导氧化应激来促进肾纤维化（ 63 ）。晶体群中积累了多种尿毒症毒素，表明CaOx引起肾小球滤过率下降，尿毒症毒素会进一步加速肾功能不全的进展。

炎症相关信号通路的变化

作为组织损伤和炎症的重要标志物，粘附分子在炎症反应中起重要作用。与对照组小鼠相比，与细胞粘附相关的途径（例如，ILK信号传导，整合素信号传导，肌动蛋白细胞骨架信号传导以及Rho家族GTP酶和RhoA信号传导）在Crystal组的小鼠中显着上调。ILK是一种细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在NF-κB激活中起着至关重要的作用。NF-κB是炎症的重要调节剂，在调节炎症反应中起着关键作用。ILK可以通过细胞外基质（ECM）与整合素或炎症刺激（例如脂多糖（LPS）和Tnf-α）之间的相互作用通过PI3K途径激活。活化的ILK磷酸化NF-κB的p65亚基，触发NF-κB核易位和下游基因（炎性细胞因子，趋化因子，粘附分子等）表达。整合素是跨膜细胞表面分子家族，构成ECM的主要粘附受体，对于多细胞生物的存在是必不可少的（64）。聚集在基质粘附位点内的整合素的能力调节信号转导途径，这些途径不仅调节细胞粘附和运动，还调节基因表达。整合素可与粘附分子（例如 Icam 和 Vcam）相互作用，诱导细胞质尾部的必要构象变化，从而触发促炎信号传导。在我们的研究中，蛋白质组学结果和生物化学分析都表明，与对照组相比，Crystal组中的Icam和Vcam显着上调。肌动蛋白细胞骨架是真核细胞的基本结构成分，其对非生物和生物刺激有反应（65）。肌动蛋白细胞骨架也是炎症中细胞功能的核心，例如整合素介导的细胞粘附部分取决于肌动蛋白细胞骨架（的重组66，67）。最近的研究表明，平衡的肌动蛋白丝周转可以保护上皮屏障并减轻体内粘膜炎症期间的组织损伤（68）。在我们的研究中，如所示 图 4 两种肌动蛋白捆绑蛋白Lcp1和Coro1a与肌动蛋白直接相关，在晶体组中显著上调。Lcp1主要在白细胞中表达，并调节白细胞粘附和信号转导（67）。Coro1a属于进化保守的肌动蛋白结合蛋白家族。在炎症期间，Coro1a是β2整合素的新型调节剂，通过诱导粘附，粘附增强，扩散和迁移来调节多形核中性粒细胞（PMN）的运输（69）。RhoA被认为是Rho家族的小型GTP酶，参与许多细胞过程，包括细胞结构，ROS形成，细胞粘附和迁移，细胞凋亡，肌动蛋白细胞骨架运动和细胞分化（70）。Rho激酶（ROCK）具有ROCK1和ROCK2亚型，并且RhoA / ROCK信号通路已被证明与免疫系统激活水平和促炎因子的产生有关，其具有许多类型的下游靶标，包括NF-κB，肌球蛋白轻链（MLC），MLC磷酸酶（MLCP）和肌球蛋白磷酸酶靶向亚基-1（MYPT-1）。作为ROCK的重要下游靶标，NF-κB激活程度与炎症严重程度之间存在很强的关系（71）。

氧化应激相关途径的变化

一氧化氮和ROS主要由线粒体电子传递链，NADPH氧化酶和过氧化物酶产生（72）。在正常的生理条件下，NO和ROS的产生和清除之间存在平衡。然而，当身体产生过量的ROS时，超过抗氧化防御系统的清除能力，过量的ROS可能通过破坏或修饰蛋白质，核酸，脂质和其他生物大分子来影响细胞存活，导致组织损伤。ROS生成诱导DNA氧化损伤，随着促炎因子的激活，导致肾小管和内皮细胞死亡。此外，炎症可能会进一步放大氧化应激。炎症和氧化应激之间的相互关联的过程最终导致肾损伤。规范通路分析显示，巨噬细胞中NO和ROS的产生显著增加，相关蛋白Akt1、Apod、Apoe、Clu、Cybb、Fnbp1、Lyz、Mapk3、Ncf2、Nfkb2、Rela、Rhob、Rhoc、Rhog和Sirpa在Crystal组上调，Cat（蛋白质组学数据）在模型组中下调。此外，如 所示 图 5 ，GSH-Px和Sod在Crystal组中被下调，MDA被上调。MDA是脂质过氧化的最终产物，增加的MDA表明机体处于脂质过氧化状态。Sod、GSH-Px和Cat是常见的抗氧化物质，它们在晶体组中均有所下降，表明机体的ROS清除能力降低。

粮农组织途径的变化

IPA的规范通路分析表明，FAO在晶体组中被显着下调。与对照组相比，晶体组对中链特异性酰基辅酶A脱氢酶（Acadm）、长链脂肪酸-辅酶A连接酶1（Acsl1）、甲基谷氨酸辅酶A水合酶（Auh）、过氧化物酶双官能酶（Ehhadh）、羟酰辅酶A脱氢酶（Hadh）、异戊酰辅酶A脱氢酶（Ivd）和非特异性脂质转移蛋白（Scp2）等相关蛋白均下调。这些酶是参与线粒体FAO的重要酶，特别是Acadm，其缺乏是FAO最常见的疾病，也是最常见的先天性代谢错误之一（ 74 ）。 细胞能量代谢中最有效的ATP生成系统是线粒体FAO，它可以产生106-129个ATP，这取决于FA链中的碳数量。肾脏是一个高度代谢的器官，使用高水平的ATP来维持电解质和酸碱稳态并重吸收营养。能量消耗是各种肾脏发育和进展的关键因素。一些文献研究还表明，近端小管中的FAO是ATP产生的主要来源（ 75 ）。FAO是肾脏中ATP的首选来源，其功能障碍导致ATP消耗和脂肪毒性，从而引发肾小管损伤和炎症以及随后的纤维化进展（ 76 ）。Kang等人发现，肾小管上皮细胞中的缺陷脂肪酸氧化在肾纤维化发展中具有关键作用（ 77 ）。 在粮农组织的过程中，长链脂肪酸首先被活化为酰基辅酶A，使其通过细胞质基质中的酰辅酶A合成酶渗透到外线粒体膜（OMM）。位于OMM上的肉碱棕榈酰转移酶-1（Cpt-1）催化酰基辅酶A向酰基肉碱的酯交换反应。酰基肉碱通过肉碱-酰基肉碱转座酶穿过线粒体内膜（IMM）。酰基肉碱通过IMM蛋白Cpt-2再转化为酰基辅酶A。因此，Cpt-1或Cpt-2对于脂肪酸的正常氧化至关重要;几项研究表明，在缺血性、顺铂 AKI 和糖尿病肾病等各种肾脏疾病中，下调或缺乏 Cpt-1 或 Cpt-2 对受损的 FAO 至关重要 （ 78 – 80 ）。从代谢组学数据中，我们发现晶体组的总长链酰基肉碱比对照组增加，这表明Cpt-2将酰基肉碱再转化为酰基辅酶A的过程中存在紊乱。酰基辅酶A的β氧化涉及脱氢、水合、再氢化和硫解。作为β氧化循环第一步和第三步的重要限速酶，Acadm和Hadh在晶体组中被还原。此外，Acsls还可以将游离的长链脂肪酸转化为酰基辅酶A，并在脂肪酸代谢中起关键作用（ 81 ）。在我们的研究中，Acsl1在Crystal组中被下调。另一方面，脂肪酸代谢物苯乙酰甘氨酸作为线粒体FAO受损的重要标志物（ 82 ），在Crystal组中上调（34.454倍）。综上所述，FAO在水晶组小鼠中受到明显干扰。

结论

在我们的研究中，结合蛋白质组学和代谢组学的综合策略和IPA生物信息学分析，我们筛选了代谢分析，蛋白质分析在CaOx晶体诱导的肾损伤小鼠中发生了显着变化，发现CaOx晶体可以通过Akt，ERK1 / 2，p38 MAPK途径诱导炎症反应和氧化应激，并影响氨基酸代谢和脂肪酸β氧化， 导致肾损伤。

Front Med (Lausanne)

. 2022 Mar 3;9:805356.

 doi: 10.3389/fmed.2022.805356. eCollection 2022.

An Integrated Proteomics and Metabolomics Strategy for the Mechanism of Calcium Oxalate Crystal-Induced Kidney Injury

Songyan Gao 1, Yufan Chao 2, Na Li 2, Henghui Li 3, Hongxia Zhao 2, Xinru Liu 1, Wei Chen 4, Xin Dong 1 2

Affiliations expand

PMID: 35308536

PMCID: PMC8927618

DOI: 10.3389/fmed.2022.805356

Free PMC article