车晓芳教授谈单细胞测序技术揭示食管鳞癌微环境异质性

文章简介：

肿瘤微环境是一个由多种细胞组成的高度复杂的生态系统，塑造了癌症生物学并影响其对治疗的反应性。本研究利用13例ESCC肿瘤组织、9例癌旁组织样本及3例患者外周血单核细胞进行单细胞转录测序，发现大多数食管鳞癌（ESCC）微环境中的基质细胞，特别是成纤维细胞和免疫细胞存在异质性。通过大量生信分析及组织切片的多色染色验证，鉴定出具有预后价值和潜在生物学意义的肿瘤特异性CST1+肌成纤维细胞亚群，发现并验证了具有抗原递呈功能的成纤维细胞亚群；对髓系和T淋巴系免疫细胞的分析证明了ESCC的免疫微环境的异质性，并确定了免疫检查点的细胞亚群特异性表达。

研究背景：

食管鳞状细胞癌（ESCC）是常见的恶性肿瘤之一（每年>400,000例），其5年生存率低于20% 。最近，免疫治疗在ESCC患者中显示出不错的疗效，然而，与大多数实体瘤一样，只有少数ESCC患者（20-30%）可以从抗PD-1治疗中获益。前期研究发现免疫治疗疗效差与个体肿瘤免疫细胞组成的异质性有关。因此，更好地了解ESCC微环境中的免疫细胞组成，将有助于确定细胞反应性或免疫治疗耐药的潜在机制。

肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）是一个包含多种细胞类型的复杂“生态系统”，对肿瘤生物学特性的塑造至关重要。TME包括各种免疫细胞和非免疫基质细胞，在肿瘤进展中起关键作用。探索ESCC复杂的肿瘤微环境（TME）是建立早期诊断和精确治疗的基础。

单细胞转录组测序（scRNA-Seq）可在单细胞水平分析基因表达网络，能够高分辨率地表征不同系统中的细胞异质性、发育和分化状态，该方法已被应用于分析多种癌症类型的肿瘤微环境。

研究思路：      

重要结果：

一、 肿瘤特异性CST1+肌成纤维细胞与ESCC预后不良相关

成纤维细胞F_3亚群在ESCC肿瘤中的表达丰度明显高于癌旁组织，并发现F_3亚群的特异性分子CST1，其丰度与OS和DFS显著相关。      

二、ESCC 的免疫细胞微环境

不同的CD4亚群表达不同的免疫检查点；2个CD8+亚群表现出肿瘤特异性；肿瘤组织和T细胞相互作用的细胞总数显著增高，并且免疫检查点抑制剂及其配体：PD1-PDL1和CTLA4-CD80/86在肿瘤中的相互作用评分高于癌旁组织。      

三、ESCC中的髓系细胞多样性

DC具有高度多样性；不同的单核细胞亚群在ESCC微环境中的具有免疫调节和促肿瘤作用。巨噬细胞亚群中，Mac 1-3表达了较高的抗炎M2型相关基因；Mac5的特征是特异性表达干扰素刺激基因。

四、候选细胞亚群的验证

对组织样本进行免疫荧光验证显示肿瘤中CST1+成纤维细胞、CD8+ T 细胞、Treg细胞以及M2巨噬细胞均增加；M2巨噬细胞的丰度与CD8+ T细胞的丰度显著相关；CST1+成纤维细胞和Treg细胞显著相关。

机制总结：

本研究用单细胞测序的方法揭示了ESCC中大多数细胞类型的异质性，特别是成纤维细胞和免疫细胞。鉴定出的提示预后不良的CST1+肌成纤维细胞亚群，并确认了CST1高表达与多种肿瘤的不良预后相关。通过对癌及癌旁组织的对比，进一步突出了ESCC免疫抑制的微环境：1)CD4+和CD8+T细胞肿瘤特异性的表达不同的免疫检查点；2)Treg细胞在肿瘤样本中更丰富；3)M2样巨噬细胞(Mac_1、Mac_2和Mac_3)表达抗炎因子，而M1样亚群(Mac_5)在肿瘤样本中特异性表达PD-L1；iv)不同的单核细胞亚群表达不同的免疫调节和促肿瘤因子。

文献抄读：赵佳

中国医科大学附属第一医院肿瘤内科主治医师

辽宁省细胞生物学学会肿瘤支持与姑息治疗专业委员会委员

专家点评： 01

发现新标志物

这项研究首次鉴定出食管鳞癌肿瘤组织特异性的CST1+成纤维细胞亚群，且比例高的患者预后差，提示CST1+肌成纤维细胞亚群具有良好的预后预测作用。进一步扩展癌种进行验证发现，CST1+成纤维细胞亚群在肺癌、肠癌、头颈癌等的肿瘤组织中也特异性存在，提示其具有成为普适的肿瘤不良预后生物标志物的潜能。

02

深刻描绘肿瘤微环境特征

研究利用10X Genomics进行单细胞测序技术及多重免疫荧光染色（Polaris System, PerkinElmer）技术，充分展现了食管鳞癌微环境中各种细胞，特别是髓源性细胞、T细胞和成纤维细胞的高度异质性。肿瘤患者个体之间、同一患者的肿瘤组织与正常组织之间，各种类型细胞内部均存在明显的异质性。既包括CST+_F3等肌成纤维细胞、Mon_1/Mon_3单核细胞、Mac_1-Mac_3 M2型特征巨噬细胞等促肿瘤进展的细胞亚群，又包括具有抗原提呈功能的F2成纤维细胞、Mon_2单核细胞亚群、Mac_5 M1型巨噬细胞等发挥肿瘤抑制作用的细胞亚群。T细胞中CD4、CD8也包括不同功能、及处于激活或耗竭状态的亚群。这些结果提示了肿瘤微环境的复杂性，各种类型细胞在彼此影响和驯化作用下，分为肿瘤的帮凶和警察两大阵营，且同一阵营不同亚型细胞的状态也极为不同，包括精力充沛的、消极怠工的、疲惫不堪的等各种状态，像极了复杂的社会环境。作者通过差异基因分析及细胞互作分析，结合大量的文献，系统描绘了各种细胞特异性基因的表达意义，及细胞间如何相互影响共同形成免疫抑制微环境来促进ESCC的进展；通过比较肿瘤组织和外周血单细胞亚型、基因表达差异，及轨迹分析，初步揭示了ESCC微环境中不同的髓样细胞从外周血进入肿瘤组织内的分化轨迹和分化背后可能的重要转录程序。

03

展望  

肿瘤的不同发展阶段、不同部位及治疗前后，肿瘤微环境中的基质细胞及免疫细胞等的类型、数量、功能状态及调控网络构成了肿瘤复杂的时空异质性，对肿瘤的预后及疗效具有重要的影响。利用单细胞测序技术，进行组织内单细胞水平上的转录组测序，提供了一种表征组织异质性的方法，对于全面了解肿瘤微环境特征，深刻理解肿瘤微环境的各种细胞相互作用促进肿瘤增殖、转移、肿瘤免疫逃逸的机制，鉴定影响不同预后及疗效的关键分子特征，探索新的治疗策略具有重要的指导意义。这项研究中鉴定出同种细胞的不同亚型可能具有不同的分子特征及功能状态，这些异质性可能是ESCC预后差异及对免疫治疗差异的关键因素。后续通过构建多因子多维度的预后或疗效预测模型，可更好地指导肿瘤精准诊疗。癌相关成纤维细胞（CAF）是TME中占比最多的基质细胞，主要来源于组织中固有的成纤维细胞或星状细胞、上皮细胞、脂肪细胞、周细胞、内皮细胞、平滑肌细胞，及髓源性间充质细胞也可以分化成CAF。越来越多的利用单细胞测序技术的研究发现，CAF具有异质性，主要分为肌成纤维细胞myCAF、炎性成纤维细胞iCAF和具有抗原提呈作用的成纤维细胞apCAF。不同功能的CAF与不同来源的CAF是否存在某种对应关系，决定成纤维细胞分化方向的关键因素和机制等也是今后值得探讨的问题。此外，肿瘤组织和外周血免疫细胞的不同特征及分化轨迹的描绘，为明确形成肿瘤微环境特征的关键外周血中的免疫细胞提供了依据，进一步明确外周血关键免疫细胞及细胞因子等特征以探索如何利用液体活检进行免疫治疗人群筛选及疗效动态监测，也是今后的研究方向。

点评专家：车晓芳

中国医科大学附属第一医院肿瘤内科教授、研究员、硕士生导师，沈阳市领军人才，中国抗癌协会肿瘤肿瘤标志物专委会肿瘤标志物临床转化研究协作组委员，肿瘤药物临床研究专业青委会委员，中国老年学和老年医学学会肿瘤康复分会委员/精准医疗分会委员，辽宁省免疫学会理事/肿瘤免疫分会副主委/青委会副主委，辽宁省抗癌协会肿瘤生物治疗专委会常委，辽宁省药学会药物临床评价研究专委会委员。发表第一及通讯作者SCI论文47篇，获专利1项，辽宁省科技进步一等奖等省市级奖项6项曾获日本文部省基金等课题10余项；归国后承担国家自然基金2项，省市级课题4项，作为骨干参与科技部重大慢性非传染性疾病防控研究重点专项1项。

关键词：食管鳞癌、单细胞测序、CST1+成纤维细胞、免疫抑制微环境

文献题目：Integrated single-cell transcriptome analysis reveals heterogeneity of esophageal squamous cell carcinoma microenvironment

全部作者：  Dinh HQ, Pan F, Wang G, Huang QF, Olingy CE, Wu ZY, Wang SH, Xu X, Xu XE, He JZ, Yang Q, Orsulic S, Haro M, Li LY, Huang GW, Breunig JJ, Koeffler HP, Hedrick CC, Xu LY, Lin DC, Li EM. 

出版时间：  2021年12月 

影响因子：  14.919