香港华人群体中粘附性侵袭伴严重肠黏膜失调与克罗恩病的关系

导读  

粘附性侵袭性Escherichia Coli(AIEC)与西方人群克罗恩病(CD)的发病机制有关。目前尚不清楚，不同遗传易感性的CD人群中是否也存在AIEC，并对宿主的微生物群生态和治疗产生不利影响？本文对60例香港华人CD患者和56例正常人回肠组织中AIEC的存在情况进行了评估，还通过16s rRNA测序对黏膜微生物群进行了分析，并在小鼠模型中测定了AIEC对肠道菌群的影响。与对照组相比，AIEC在CD患者回肠组织中更为普遍(30% vs 7.1%)。回肠组织中AIEC的存在与CD患者的黏膜微生物菌群失调程度加重有关，Firmicutes（厚壁菌门）的多样性和丰度降低，包括产生丁酸盐的Roseburia（罗氏菌属）和益生菌Bacillus（芽孢杆菌属）。随机森林模型预测了AIEC的存在，其曲线下面积为0.89。AIEC加重了右旋糖酐硫酸酯钠盐(DSS)诱导的结肠炎小鼠的微生态失调，导致对粪便微生物群移植(FMT)恢复正常肠道微生物菌群的抵抗。AIEC定植小鼠的供体来源细菌比例明显低于未感染小鼠。AIEC在香港华人人群中普遍存在，并与严重的黏膜菌群失调有关。AIEC的存在阻碍了正常肠道菌群的恢复。AIEC可能是CD中的一个关键细菌，影响FMT的疗效。

实验设计

结果

1 中国香港华人AIEC的流行情况及特点

我们检测了56例健康对照者和60例CD患者中AIEC存在情况，60例CD患者中22例回肠末端发炎，38例回肠末端未发炎。从5例部分回肠炎患者的炎症区和非炎症区的取相互对照组织(表1，表2，附表1)。60例CD患者回肠粘膜中有18例(30%)有AIEC表达，56例健康对照者中有4例(7.1%)有AIEC表达(p < 0.05，卡方检验)。炎症区和非炎症区组织中AIEC的检出率相当(31.8%和28.9%)。从部分炎症性回肠组织中收集的配对组织中，两者都有(n=2)或一个也没有(n=3)的炎性和非炎性组织中均可检测到AIEC菌株。

炎症组织中粘膜相关大肠杆菌的载量与非炎症回肠组织相比没有显著差异(p = 0.49, 附图1a-b)。从炎性回肠组织分离的AIEC株与非炎性回肠组织分离的AIEC株的侵袭能力无显著差异(p =0.81，附图1c)。21株CD粘膜相关AIEC中有12株(57.1%)对庆大霉素耐药。根据粘膜组织中AIEC的存在情况，CD患者样本可分为AIEC阳性和AIEC阴性两类。AIEC阳性组织的粘膜相关大肠杆菌载量高于AIEC阴性组织(CD组织p = 0.064，对照组织p < 0.001，t检验, 附图1d)。

表1. 人群的人口特征。

* Fisher’s精确检验用于分类数据之间的统计比较。数字资料间采用不成对t检验进行统计学比较。

表2. 在中国香港人群中分离的 AIEC 菌株的特征。

2 AIEC与CD患者的微生态失调有关

为探讨AIEC对人体粘膜微生物区系的影响，对63例活检标本进行了16S核糖体RNA序列测定，其中包括18例AIEC阳性CD患者(3对炎症组织和非炎症组织)的21例活检组织，17例AIEC阴性患者的活检组织和25例健康对照者的活检组织。CD组织中Chao1的丰富度显著低于对照组织(p <0.001，Wilcoxon秩和检验)，而Shannon多样性指数在CD组织与对照组织之间无显著差异(p =0.19，Wilcoxon秩和检验, 附图1e)。CD组织的总体微生物群组成与对照组织显著不同(p =0.019，置换多元(因素)方差分析，图1a)。AIEC阳性组织的Shannon多样性指数和Chao1丰富度显著低于AIEC阴性组织和对照组织(分别为p =0.033和p =0.042，Wilcoxon秩和检验，图1b)。

AIEC阳性CD组织与AIEC阴性CD组织和对照组织的菌群组成有显著差异 (p = 0.023, 置换多元(因素)方差分析，图1a)。亚组分析显示，与对照组相比，AIEC阳性CD组织中的微生物群落组成有显著差异(p = 0.048, 置换多元(因素)方差分析，图1a)。在AIEC阴性的炎症组织和对照组之间(p = 0.052)，以及在AIEC阳性和AIEC阴性的CD组织之间(p = 0.249, PERMANOVA，图1a)没有观察到显著差异。AIEC阳性菌群的组内变异显著高于aiec阴性组织(p <0.001, Wilcoxon秩和检验，图1c)。线性判别分析效应量(LEfSe)分析显示，AIEC阳性和AIEC阴性菌群之间有76个类群差异丰富(LDA>2, p <0.05图1d)。与AIEC阴性组织相比，AIEC阳性组织富集了Peptoniphilus、Finegoldia和Mycetocola，降低了Bacteroides、Coprococcus、Sutterella、Roseburia、Megamonas、Delftia、Moraxella、Bacillus、Lactococcus、Anaerostipes (LDA>2, p <0.05,图1d)。在门水平上，与AIEC阴性组织相比，AIEC阳性组织中厚壁菌门减少(p = 0.045，Wilcoxon秩和检验，图1e)。

图1. 健康受试者和CD患者中存在或不存在AIEC的粘膜微生物群。

(A)粘膜样本中的微生物群Chao1丰富度和Shannon多样性指数，显著性是根据Wilcoxon秩和检验计算的；(B)粘膜样本的PCoA分析是基于加权UniFrac距离矩阵。在AP、AN和对照组组织中观察到微生物组组成的显著差异（P =0 .023，PERMANOVA）。亚组分析显示，与对照组相比，AIEC阳性的CD组织中的微生物组组成有明显差异（p =0 .048，PERMANOVA）；（C）AP组织的组内加权UniFrac距离明显高于AN和对照组（p < 0.001，Wilcoxon秩和检验）；（D）通过LEfSe描述AP和AN组织之间不同含量的分类群。显示了LDA >2和调整后p <0.05的分类群；(E)描述了厚壁菌门的相对丰度（%）。AP，AIEC阳性；AN，AIEC阴性；PCoA，主成份分析。LefSe：线性判别分析效应大小；LDA: 线性判别分析。

3 粘膜微生物群的组成可以预测 CD患者中AIEC的存在

我们接下来评估了使用肠道微生物群作为生物标志物预测AIEC存在的潜在价值，发现基于12个标志物的随机森林模型产生的接受者操作特征（AUC）下的面积为0.89（图2a-b, 附图2）。该模型显示AIEC阴性的平均灵敏度为0.83，特异性为0.85，测试集的总体准确度为0.84。在12个标记物中，属于Proteobacteria和Fusobacteria的两个标记物在AIEC阳性样品中被富集，而属于Actinobacteria, Bacteroidetes 或 Firmicutes的10个标记物在AIEC阳性样品中减少（图2b）。基于这12个标记物丰度的层次聚类显示，大多数AIEC阳性组织与AIEC阴性组织和对照组织形成了一个独特的聚类（图2c），表明这些分类学变化是AIEC存在的特定因素。

图2. 通过一个RF模型，根据粘膜微生物组特征对AIEC的存在进行分类。通过随机分层抽样，将AP和AN样本分为80%的训练集（n = 30）和20%的测试集（n = 7）。每个特征的重要性由训练集决定，模型的预测准确性由测试集决定。(A）在AP和AN的最终模型中，分类学、重要性和平均重要性得分最高的12个标记的相对丰度。标记的丰度被绘制在对数尺度上，0的值被分配为计数=1。(B)RF预测模型，测试集的ROC下面积为0.89。(C)基于12个标志物OTU丰度的层次聚类，对AIEC阳性和AIEC阴性的CD组织具有鉴别作用。AIEC阴性的CD组织。AP，AIEC阳性；AN，AIEC阴性；CD。克罗恩病；RF，随机森林；ROC，接收操作曲线。

4 AIEC阳性组织中的微生物功能失调

为了研究AIEC阳性和AIEC阴性的微生物群落的功能和代谢变化,我们接下来使用PICRUST2从16S rRNA数据中推断出功能潜力。LEfSe分析确定了18个KEGG同源性分析（KO）在AIEC阳性和AIEC阴性的CD组织之间有明显的不同（LDA>2.0，p <0.05，图3）。与AIEC阴性组织相比，AIEC阳性组织中遗传信息处理和环境信息处理的类别中的多个KO减少。与脂多糖（LPS）生物合成有关的代谢途径（NAGLIPASYN-PWY和PWY-6467）在AIEC阳性组织中明显富集，而几种氨基酸生物合成的途径（L-精氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸等），与AIEC阴性的组织相比，AIEC阳性的组织中减少。

图3 宏基因组预测的功能分析。气泡图描绘了AP之间丰富的KEGG同源序列差异(n = 20)和AN (n = 17)。x轴表示调整后的p值，气泡图的大小表示每个KO的LDA效应大小。AP,AIEC阳性;AN,AIEC阴性;LDA，线性判别分析;LEfSe，线性判别分析效应大小。

5 AIEC加剧了DSS诱导的结肠炎小鼠的微生物群失调，并妨碍了 DSS诱导的结肠炎小鼠通过FMT恢复正常的肠道菌群

我们进一步阐明了AIEC对右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠肠道菌群的影响。用从香港CD患者分离的AIEC株(AIEC 62d)或非致病性大肠杆菌株K12接种C57BL/6小鼠（图4a）。选择AIEC菌株的原因是其入侵能力与AIEC参考菌株LF82相当。将健康小鼠粪便注入AIEC感染小鼠体内，研究FMT是否能恢复AIEC相关的生态失调（图4a）。根据人类的数据，与K12小鼠相比，AIEC小鼠的结肠粘膜相关微生物群中厚壁菌门较少（p = 0.11，Wilcoxon秩和检验，图4b）。与K12小鼠相比，AIEC小鼠的细菌属Allobaculum、Anoxybacillus、Sutterella、Selenomonas、Bifidobacterium、Adlercreutzia、AF12和Anaerofustis明显减少（LDA>2，p < 0.05, 附图3）。AIEC感染的小鼠粘膜中的Shannon指数低于K12小鼠（p = 0.11，Wilcoxon秩和检验，图4c）。FMT后K12小鼠中来自供体的微生物平均占50.1%，而AIEC小鼠中来自供体的微生物仅占17.5%（p < 0.05，Wilcoxon秩和检验，图4d-e）。K12小鼠和对照小鼠的组织样本之间的加权UniFrac距离明显小于AIEC感染小鼠和对照小鼠之间的距离（p = 0.025，Wilcoxon秩和检验，图4f-g），说明与AIEC感染的小鼠相比，K12小鼠的组织微生物群和对照组小鼠的组织微生物群更类似。

图4. AIEC对FMT后小鼠肠道微生物群的影响。(A) 研究方案；(B) 箱线图描述了AIEC小鼠和K12小鼠粘膜微生物区系的相对丰度（%）；(C) AIEC小鼠和K12小鼠粪便和粘膜微生物区系的Shannon指数；(D-E) 由SourceTracker确定的受体小鼠微生物区系来自不同来源的比例。"未知 "是指FMT后受体微生物群中的OTU，在FMT前既不是来自供体也不是来自受体小鼠；（F）基于AIEC小鼠、K12小鼠和对照小鼠的粘膜微生物群的加权UniFrac矩阵的PCoA分析。对照组小鼠。(G) Boxplot描述了AIEC小鼠和对照组小鼠的FMT后样本之间的加权UniFrac距离，以及 K12小鼠和对照组小鼠之间的加权UniFrac距离。PCoA，主坐标分析 组间差异用Wilcoxon 秩和检验。* p < 0.05。

6 持续的AIEC感染阻碍了结肠炎的恢复

在第9天和第12天，FMT小鼠的粪便AIEC水平显著低于PBS对照组小鼠（最后一次FMT后0—3天，p < 0.05，Wilcoxon排名和检验，图5a）然而，在第14天，FMT和PBS组的小鼠之间的粪便AIEC水平没有明显差异（图5a）。荧光原位杂交（FISH）显示，在FMT治疗后，小鼠结肠上皮细胞内仍有AIEC（图5b）。FMT后， K12小鼠的结肠长度明显长于FMT前，但不包括AIEC感染的小鼠（p < 0.05，Tukey’s检验，图5c）。K12小鼠和AIEC感染的小鼠在FMT后第14天的粪便Lcn-2水平都明显低于FMT前（p < 0.001和p = 0.048，Tukey试验，图5d）。与第 14 天的 K12 小鼠相比，AIEC 感染小鼠的 FMT 后粪便 Lcn-2 水平显着升高（p = 0.028，Tukey's检验，图5d）。在第12天，与FMT后的AIEC感染小鼠相比，FMT后的K12小鼠的体重明显较高（p < 0.001，Tukey's检验，图5e）。

接受FMT的K12小鼠的组织学评分明显低于接受PBS和FMT前的K12小鼠（p = 0.012和p < 0.001，Tukey试验，图5f-g）。与K12小鼠相比，AIEC感染小鼠的FMT后组织学评分明显较高（p < 0.001，Tukey试验，图5f-g）。另一方面，与PBS组和FMT前组相比，AIEC感染小鼠FMT后组织学评分无明显改善（图5f-g）。

图5. AIEC感染对FMT后结肠炎恢复的影响(A)小鼠粪便中的AIEC负荷以CFU/mg的log10值表示；(B)FISH染色显示细胞内大肠杆菌的位置。(蓝色：DAPI，绿色：大肠杆菌特异性探针）；（C）小鼠处死时的结肠长度（毫米）；（D）FMT前后的粪便Lcn-2水平；（E）实验第12天的体重变化（自最后一次FMT后3天；(F-G)小鼠结肠的HE染色以及FMT前后AIEC和K12小鼠的组织学评分。FISH, 荧光原位杂交；* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p <0.001。

讨论

我们研究发现香港华人中AIEC的流行率与西方国家的流行率相当。这表明，尽管亚洲人和白种人的遗传背景和生活方式不同，但这些细菌可能是全球性的危险因素。我们首次表明，AIEC与人类的粘膜微生物群失调有关。利用动物模型，我们证实，AIEC感染与微生物群的多样性和厚壁菌门的丰度下降有关，模拟了人类的菌群失调模式。AIEC可以阻碍FMT对正常肠道微生物群的恢复，并阻碍化学药物诱导的结肠炎的恢复，突出了AIEC在启动和维持粘膜菌群失调中的作用。

在伴有部分回肠炎症的CD患者中，AIEC菌株在炎症组织和非炎症组织中都有恢复，或者没有恢复，这表明AIEC以全部或全无的方式定植在回肠中，而且AIEC可能不需要预先存在的炎症才能在人类肠道中定植。这表明AIEC的存在不是炎症的结果，而是可能起到疾病的因果关系或加重作用，这加强了必须努力限制CD患者的这些细菌。

目前，对AIEC菌株的鉴定完全依赖于对细菌和宿主细胞之间相互作用的评估。这种基于培养的方法非常耗时耗力，而且需要严格处理临床样本以保持细菌的活力。由于缺乏区分AIEC病原体和其他大肠杆菌菌株的特异性分子标记，使得以往的微生物学研究无法研究AIEC对微生物群的影响。通过收集同一患者的多次回肠活检，评估AIEC和粘膜微生物群的存在关系，我们将我们的CD队列分为AIEC阳性和AIEC阴性组。由12个标志物组成的随机森林模型能够准确区分AIEC阳性和AIEC阴性的微生物群。虽然这是一个样本量有限的单中心研究，但我们基于粘膜微生物组图谱提供了一种检测AIEC的替代方法。

与AIEC阴性和对照组微生物群相比，AIEC阳性患者的粘膜微生物群显示出更严重的菌群失调，细菌多样性明显降低。与未感染的小鼠相比，被AIEC定植的小鼠的粘膜微生物群也显示出较低的多样性。这表明，AIEC感染与粘膜微生物群的丰富性和均匀性的降低有关。在人类中，与AIEC阴性的微生物群相比，AIEC阳性的微生物群有几个属的丰度较低，包括Coprococcus、Roseburia、Bacillus、Lactococcus和Anaerostipes。据报道，与健康对照组相比，这些菌属在IBD患者中都减少了。与K12小鼠相比，用AIEC定植的小鼠的粘膜微生物群也显示出有益菌属的减少，如双歧杆菌。值得注意的是，感染了AIEC的人类和小鼠都显示出厚壁菌门的显著减少，这些菌类一直被报道为与CD有关。人类和小鼠中AIEC相关的菌群失调与CD样菌群的相似性表明，AIEC可能通过促进粘液蛋白的降解和渗透粘液层在诱发菌群失调方面发挥了因果作用，从而加强了细菌通过粘膜层的转位并粘附到肠上皮细胞。

AIEC阳性患者的粘膜微生物群富含LPS生物合成基因和LPS生物合成蛋白，这导致了促炎症细胞因子的增加。这与以前的研究相一致，即AIEC定植推动了慢性炎症，这与 Toll 样受体 5 敲除小鼠中具有较高水平的生物活性 LPS 和鞭毛蛋白的微生物群成分相关。此外，与AIEC阴性组织相比，几个氨基酸生物合成的途径（L-精氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸等）在AIEC阳性组织中减少。这些结果表明，AIEC感染与粘膜微生物群的功能失调有关。

FMT能有效地改善DSS诱导的实验性结肠炎，并开始恢复肠道的平衡状态。从概念上讲，恢复 "健康 "的肠道微生物群可以扭转CD中不适当的免疫粘膜刺激，为AIEC的定植创造一个不太合适的环境。然而，我们的数据显示，在DSS结肠炎模型中，FMT只能暂时减少粪便中的AIEC负荷，但不能完全根除小鼠肠道中的AIEC。AIEC感染导致FMT对结肠炎的疗效受损，阻碍了 "健康 "微生物群的恢复。AIEC的存在与FMT后供体来源的微生物比例较低明显相关，这与治疗效果不佳有关。FMT治疗的疗效因不同微生物组谱的受者而异。AIEC可以诱导TNF-α、IFN-γ和IL-8的表达增加，导致巨噬细胞和树突状细胞募集到感染的部位。免疫反应的增加可能使共生菌和有益菌更难在发炎的肠道中定植。此外，AIEC还可引起肠道屏障功能障碍（肠漏），使其他细菌更容易穿透肠道屏障。因此，通过将各种外来细菌引入发炎的肠道，FMT可能不会改善，甚至会使疾病的严重程度恶化。这些数据表明，AIEC通过阻碍供体来源的细菌的移植，影响肠道炎症的不完全恢复和正常肠道菌群的恢复，从而影响FMT的疗效。

总之，在香港华人群体中，AIEC与回肠CD有关。AIEC的存在与CD患者和结肠炎小鼠模型严重的粘膜微生物群失调有关。AIEC的存在可能通过阻碍有益细菌的移植而损害FMT的疗效。这些数据进一步表明AIEC阳性的回肠CD可能代表该疾病的一个亚型，应该考虑具体的根除策略。

打赏