快报 | 重叠延伸聚合酶链反应快速高效检测结核分枝杆菌耐药性技术的构建与评价

Establishment and evaluation of an overlap extension polymerase chain reaction technique for rapid and efficient detection of drug-resistance in Mycobacterium tuberculosis.

Li J, Ouyang J, Yuan J, Li T, Luo M, Wang J, Chen Y.

Infect Dis Poverty, 2022, 11(1): 31.

doi: 10.1186/s40249-022-00953-5.

PMID: 35321759

近日，Infectious Diseases of Poverty 杂志发表了重庆市公共卫生医疗救治中心的一项关于重叠延伸聚合酶链反应快速高效检测结核分枝杆菌耐药性技术的构建与评价的研究（Establishment and evaluation of an overlap extension polymerase chain reaction technique for rapid and efficient detection of drug-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Li J, Ouyang J, Yuan J, et al. Infect Dis Poverty, 2022, 11(1): 31. doi: 10.1186/s40249-022-00953-5）。研究采用重叠延伸聚合酶链反应（gene splicing by overlap extension PCR, SOE PCR），在一个反应管中将rpoB、embB、katG基因和inhA启动子的4个耐药相关片段连接，扩增为一个约700 bp的融合片段，仅需1次测序即可得到4个片段的耐药突变信息，从而获知结核分枝杆菌对利福平（rifampicin，RFP）、异烟肼（isoniazid，INH）和乙胺丁醇（ethambutol，EMB）这三种一线抗结核药物的耐药情况。重庆市公共卫生医疗救治中心的李俊刚博士和欧阳净博士为文章的共同第一作者，陈耀凯教授为论文的通信作者。

研究背景

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌通过空气传播引起的慢性传染病，是导致人类死亡最多的传染病之一。2020年全球大约有1000万例结核病患者，150万例死于结核病。特别是在低收入国家，耐药结核病（drug-resistant tuberculosis，DR-TB）的大幅增高对结核病的控制和管理提出了更加艰巨的挑战。2019年，全球约有50万例利福平耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB）患者，其中78%为耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）。

快速准确检测耐药结核病是制定有效结核病治疗策略的基石。中国在全球耐多药结核病负担中的份额位居第二，但其检出率相对较低，故进一步提高耐多药结核病的检出率对于遏制其流行态势具有重要意义。利用动态马尔可夫模型进行预测，如果我国耐多药结核病的检出率从22.5%提高至50%～70%（每年约增长5%），那么到2050年耐多药结核病的患病率将极大降低（下降约25.9%～36.2%）。临床上，传统的分枝杆菌培养和药物敏感性试验（简称“药敏试验”；drug susceptibility testing，DST）仍然是诊断耐药结核病的金标准。然而，通过传统DST获得确定的结核分枝杆菌耐药性结果需要长达数周的时间，且对实验室和实验人员有较高的专业要求，极易延误治疗时机；而现有的耐药基因检测技术虽然能实现结核病的快速诊断，但这些技术成本高、使用复杂、可及性差，均限制了它们在临床实践中的广泛应用。为此，本研究建立了一种简单、低成本和高效的DNA序列扩增策略—SOE PCR技术。并且通过对比SOE PCR技术与传统DST法和GeneXpert MTB/RIF法对108株结核分枝杆菌临床分离株的检测结果，评估SOE PCR技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药性的临床价值。

SOE PCR技术建立

以结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA序列为模板，设计rpoB、embB、katG基因和inhA启动子4个包含常见耐药突变位点的片段作为PCR引物。通过PCR验证引物有效性后，再在4个小片段序列的基础上设计rpoB与embB、embB与katG及katG与inhA片段之间的3对重叠延伸引物，即在引物rpoB_Rev(1R) 与embB_For(2F) 、embB_Rev(2R) 与katG_For(3F) 及引物katG_Rev(3R) 与inhA_For(4F) 之间分别加上不同的重叠互补序列，如SOE PCR的原理所示（图1）。在前述3对片段之间分别做重叠延伸PCR试验，即分别将rpoB与embB、embB与katG、katG与inhA片段融合，在重叠延伸PCR试验中优化重叠延伸引物。

图1  SOE PCR原理示意图

最后用rpoB上游引物、inhA下游引物和最优化的中间的3对重叠延伸引物扩增出融合的rpoB-embB-katG-inhA大片段。在rpoB上游设计测序引物以对rpoB-embB-katG-inhA融合片段进行测序，再将测得的序列与标准株H37Rv的DNA序列进行比对分析，获得氨基酸序列及相关耐药突变信息。

在SOE PCR反应体系中，引物1F和4R的浓度均高于其他6种引物，而引物2R和3F的浓度均高于引物1R、2F、3R和4F。在SOE PCR反应的初始阶段，产生了rpoB、embB、katG和inhA的双链DNA片段。随着反应循环的增加，引物1R、2F、3R、4F被耗尽，产生rpoB、embB、katG和inhA的单链DNA片段。在这个过程中，单链片段rpoB与embB之间以及katG与inhA之间存在互补重叠延伸的概率。随着反应循环的增加，引物2R和3F也被耗尽，并产生拼接的rpoB-embB和katG-inhA的单链DNA片段。在这个过程中，拼接后的rpoB-embB与katG-inhA之间存在基因拼接的概率。一旦在SOE PCR系统中产生少量的rpoB-embB-katG-inhA融合片段，就可以将其作为模板被两端引物1F和4R扩增。

试验设计

本研究在重庆市公共卫生医疗救治中心开展。试验方法为SOE PCR技术，参考方法为传统DST和GeneXpert MTB/RIF。选择2018年12月至2019年4月的108株结核分枝杆菌临床分离株，将SOE PCR技术与传统分枝杆菌培养法、DST检测以及GeneXpert MTB/RIF技术进行性能比对，并采用Kappa检验分析不同检测方法的一致性。其中，通过SOE PCR技术与DST的比较分析利福平、异烟肼和乙胺丁醇的耐药性；通过SOE PCR技术和GeneXpert MTB/RIF的比较分析其中56份样本的利福平耐药性。

研究结果

1.获得不同基因融合片段：经过SOE PCR技术的条件优化，成功地拼接出rpoB-embB、embB-katG和katG-inhA片段，表明引物设计可行，如图2所示。

注 M：标记；N：阴性对照。1～4：rpoB、embB、katG和inhA片段扩增产物；5：rpoB-embB片段扩增产物；6：embB-katG片段扩增产物；7：katG-inhA片段扩增产物

图2   琼脂糖凝胶电泳结果

2.SOE PCR技术在结核分枝杆菌耐药检测中的性能评价：通过琼脂糖凝胶电泳显示，研究成功地扩增了rpoB-embB-katG-inhA融合片段，约700 bp明亮条带为目的片段，如图3所示。融合片段经过DNA测序后分析显示，在108株临床分离株中，64株对利福平耐药，56株对异烟肼耐药，36株对乙胺丁醇耐药。这些菌株中，S531L、S315T和M306V突变在利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药中最为普遍。突变分析结果见表1。

注  M：DNA标记；N：阴性对照；1～20：扩增产物

图3  部分结核分枝杆菌DNA标本的SOE PCR产物凝胶电泳结果

与DST相比较，SOE PCR技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药性的一致性分别为94.44%、94.44%和76.85%。对于乙胺丁醇的耐药性，SOE PCR和DST之间的Kappa值为0.45，表明两种方法一致性适中；而对于利福平和异烟肼的耐药性，SOE PCR和DST之间的Kappa值均为0.89，表明两种方法一致性良好（表2）。在进行GeneXpert MTB/RIF检测的56株分离株中，SOE PCR技术检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性与GeneXpert MTB/RIF检测的一致性为100.00%，Kappa值为1.00，表明两种方法检测结果完全一致（表3）。

研究的意义及展望

研究成功地构建了一种全新的SOE PCR技术，可利用rpoB-embB-katG-inhA融合片段的扩增与测序检测结核分枝杆菌的耐药突变，具有快速检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼和乙胺丁醇等一线抗结核药物的耐药性，简化常规PCR诊断方法和测序步骤，减少工作量和降低检测材料成本等多种优势。相较于探针法或熔融曲线法，能够直接提供准确的突变信息。尤其是对于一些缺少高级别专业实验室设施的基层医疗机构，该技术可作为一种辅助诊断耐药结核病的检测方法，成为目前临床检测技术如GeneXpert MTB/RIF检测、DNA微阵列系统和基因芯片技术的替代方法。

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供稿：欧阳净

编辑：孟    莉 

审校：范永德

发布日期：2022-04-08

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