改善荧光定量PCR法的弊端，有这些新技术 | 述评

（图片来源：摄图网）

随着我国常态化新冠疫情防控措施的落实落细，检测成本较低、操作简单、易推广、准确度和灵敏度较高，且能满足短时间高通量检测的实时荧光定量PCR法在众多检测方法中被认可成为新冠检测的金标准。但是随着检测标本量的增加，荧光定量PCR法本身的一些缺点曝露的更加明显。

● 不够快：从核酸提取、试剂配制到PCR检测的操作和衔接过程需要大量精细操作，完成一轮检测至少需要2小时，不利于迅速得到检测结果；

● 检测结果干扰因素多：如样本种类、样本采集方法、样本储存运送、干扰物质、拭子类型、保存液类型、核酸提取试剂和荧光定量PCR仪稳定性都会直接影响实验结果；

● 低浓度样本的检测准确度和灵敏度不够。

为改善上述问题，研究者尝试利用多种新的扩增和检测技术，如数字PCR、电化学PCR、恒温扩增、CRISPR、微流控等技术方法来解决上述方法之不足。 

数字PCR技术

数字PCR (digital PCR，dPCR) 不需要标准曲线或内参基因，在数万个反应单元中独立检测目的序列，显著降低每个反应单元中背景基因和干扰物质的丰度，大大 提高了检测灵敏度和对特定扩增抑制剂的耐受性 。

目前主要用于稀有突变位点检测、拷贝数变异（CNV）检测、NGS文库精确定量等。 dPCR在新冠的环境样本和临界浓度新冠样本检测发挥更大的优势。 • Suo, T等分别对14例新冠疑似患者和63例确诊患者的临床样本进行dPCR和荧光定量PCR的盲样检测，对比结果发现，有26例确诊患者的荧光定量PCR检测阴性的样本，用dPCR随访检测为阳性。该文作者认为dPCR可以作为恢复期患者新冠样本检测结果再确认的补充手段。 现有的dPCR根据液体分散方式分类：微流控芯片式、自吸分液式和微滴式，其中微流控芯片是将芯片表面光刻多个腔室，通过阀门控制液体流动和分液；自吸分液式是将芯片表面进行疏水处理，微孔为亲水处理，这种亲疏水的方式可以将反应体系自动的分割为多个独立反应体系。微滴式是将反应体系通过油包水技术乳化分散在大小均一的液滴反应单元中，相比以上两种dPCR技术，微滴式dPCR仪成本更低。 已经商业化的微流控芯片式dPCR仪主要有ThermoFisher公司Quant Studio、Fluidigm公司BioMark和Forulatrix公司Constellation系统。微滴式dPCR仪主要有Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列，锐讯生物公司DropX-2000、小海龟BioDigital以及法国Stilla Technologies公司Naica System。

电化学PCR

电化学PCR是将PCR扩增和电化学生物传感器检测相结合的技术，并集成在一起，旨在提供一种 快速、小型化、手持式 仪器。电化学PCR中使用的电化学活性标签（如金属配合物、有机分子等）比荧光染料更耐用和更便宜，同时电化学法检测所需要的成本也远低于光学器件。 国外已经有一些公司利用电化学PCR技术开发出相应的微流控产品。其中Atlas Genetics io系统检测模块就是采用电化学检测方法，其电化学检测的原理为：用不对称PCR产生单链DNA，然后单链PCR产物与具有二茂铁标签的探针结合成双链DNA。核酸外切酶消化双链DNA产物，探针上的二茂铁会在水解过程释放出来，从而导致溶液中电化学性质改变，这种改变被电化学传感器检测到并转化为电信号的改变，从而到达检测的目的。 另外，GenMark公司的ePlex采用了类似于Atlas Genetics io产品的电化学检测来取代常规的荧光检测。与Atlas Genetics io不同的是，非对称扩增产生大量单链DNA后，单链DNA跟两个探针结合。一条探针被固定在电极上，一条探针被电化学标记物标记。单链DNA先一端与固定探针结合，再另一端与标记的探针结合，因为标记探针靠近了电极，从而检测到了电信号改变。 FDA最近也批准了运行在ePlex平台的GenMark ePlex® SARS-CoV-2检测试剂盒。

恒温扩增技术

恒温扩增技术 (isothermal amplification technology，IAT) 是一种在恒定温度条件下、较短时间内和特定酶作用下即可完成核酸扩增的技术。与PCR方法相比，恒温扩增技术是一种 快速、特殊、更简单、更便宜 的样品核酸检测方法。 (了解详情，  请点击“阅读原文” )

CRISPR技术

CRISPR/Cas系统是由成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因 （Clustered regularly interspaced short palindromic Repeats, CRISPR) 序列与Cas核酸酶构成，是基因组编辑的基础，该技术在分子诊断检测也越来越热门。由于其 高特异性 ，这种方法在床旁诊断中具有较大吸引力。Hou等人开发了一种名为CRISPR-covid的快速检测SARS-CoV-2，实验周期更短(~40min)，并同步与RT-PCR和宏基因组测序进行对比。 （了解CRISPR/Cas检测系统可进入专题，阅览原文及文章《CRISPR/Cas基因编辑技术在病原诊断中的应用》）

微流控技术

微流控芯片技术将核酸提取、扩增和检测集成于一起，因而可摆脱专业繁琐的操作以及对专业实验室的依赖，从而可以由非专业人员完成操作，普及到医院门急诊、床旁检测，甚至可以居家自测，受众更加广泛，临床适应性更强。此外，由于反应过程处于封闭的环境中，可以消除交叉污染的可能性，同时也避免操作者感染的风险。由于功能集成，提高了检测效率，因此可以在较短时间内完成多个项目的检测， 显著提升检测效率 。 现在主要的商业化微流控分子诊断产品包括GeneXpert全自动分子诊断平台，FilmArray全自动分子诊断平台，Atlas Genetics io系统，ePlex检测系统，Cobas Liat PCR 检测系统，Revogene全自动化分子诊断设备以及国内博晖创新的GenPlex微流控全自动核酸检测系统等。 (了解各系统优缺点，  请点击“阅读原文” )  

上述5大类技术方法各有特色和适用范围，将可能会成为在分子诊断各细分领域的主要检测方法。

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原文以《核酸扩增和检测新技术在分子诊断中的应用》为题发表在《临床实验室》杂志2022年3月刊专题“POCT分子诊断”新技术与新方法版块

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