揭开PCR抑制的神秘面纱

作者：同济大学附属东方医院胶州医院---王晓燕

       PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其产物的生成量是以指数方式增加，能将皮克(pg）量级的起始待测模板扩增到微克（μg）水平。可以从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。所以无论是化石中的古生物，历史人物的残骸，还是案发现场残留的毛发皮肤或血液，都能用PCR加以放大进行比对，这也是“微量证据”的威力所在。但是从各种生物检材中提取的DNA，其中多含有能干扰PCR的抑制物，是DNA检测失败的重要原因之一。

 行业标准与认可准则

中华人民共和国行业标准WS/T 230-2002：临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用，2.10条款也提出了抑制物/干扰物inhibition/interference的概念和分类：

CNAS-CL02-A009: 2018《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》，条款5.3明确提出了实验室设备、试剂和耗材的使用要求：

参照附录A.6的判断标准，抑制物的验收是PCR实验室重要的耗材质检内容。

 PCR抑制物的来

PCR抑制物的来源包括内源性与外源性两种：

1.内源性

天然存在标本中的组成成分。如：免疫球蛋白IgG、蛋白酶、血红蛋白及其代谢产物、血红蛋白中的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、黏蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。

尿液尿酸

高血脂

血红蛋白

粪便多糖

2.外源性

外部引入的抑制物。如：腐殖酸化合物、肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。

肝素抗凝剂

手套滑石粉

纤维素

腐殖酸化学物

PCR抑制物的一般作用机制

PCR抑制物中大部分的作用机制尚不完全清楚，但基本可以归为以下几种情况：

✦1.抑制 DNA 聚合酶的活性：有研究显示，血红蛋白、蛋白酶、尿素、多糖等物质对PCR的影响，主要是通过对DNA聚合酶的抑制，使聚合酶降解、变性、活性区域失活，影响聚合酶与引物、模板结合[1]。

✦2.阻碍样本 DNA 模板与引物结合：腐殖酸化合物包含许多羧基和羟基，具有与 DNA 磷酸骨架中的磷酸基团相似的物理化学性质［2］，会影响模板 DNA 与引物的结合，阻碍链的延伸。

✦3.形成引物二聚体和使离子浓度改变:Mg2 + 是 DNA 聚合酶的激活剂，而标本中的抑制物也会对 Mg2 + 浓度产生影响，当 Mg2 + 浓度高达 0. 015mol /L 时，可降低扩增的特异性，抑制 DNA 聚合酶［3］。

✦4.干扰核酸提取过程中的细胞裂解：细胞裂解，核酸释放使得核酸与酶作用产生扩增。如果细胞裂解不完全，核酸释放不完全，就不会产生扩增。

✦5.降解或包裹核酸：微生物如细菌产生的限制性内切酶是一个降解DNA的因素。有些细菌的DNA酶属于热稳定的核酸酶，在扩增中期可水解基因组和引物DNA。核酸和引物也因为其不能与DNA聚合酶结合而出现不扩增。如蛋白质、多糖、细胞碎片、脂类等对PCR的抑制作用，很可能就是通过对DNA的物理包裹作用而使其不能与聚合酶接触。

✦6.其他：乳胶手套上滑石粉对PCR扩增影响可能会通过其对DNA的非特异结合作用进行的。因为DNA可结合至玻璃、二氧化硅等上，这也是采用硅吸附方法提取核酸的基本原理。样本中 TG 对检测的干扰除了抑制 Taq 酶的活性，使 PCR 的扩增效率降低。另外高血脂会导致荧光猝灭，使得荧光信号强度降低［4］。血液中高IgG 对 PCR 反应抑制机制是与单链 DNA 相互作用，使得靶 DNA 不能与 DNA 聚合酶相互作用，当样本加热处理时，这种抑制作用会加强［5］。

PCR抑制物的处理

了解了PCR抑制物之后，我们要如何减少这些抑制物对结果的影响呢？

✦1.去除PCR抑制物；

✦2.增加靶核酸浓度，使其能达到特定PCR的测定范围；

✦3.增加样本的均一性，以保证测定的精密度和重复性。

✦4.稀释模板 DNA

✦5.添加 DNA 聚合酶

✦6.其 他：用氢氧化钠处理 DNA 模板，添加交联聚乙烯吡咯烷酮［29］、甜菜碱、硫酸胺铝，采用离子交换柱分析技术、免疫分析技术、凝胶电泳分离技术、磁珠杂交捕获技术等。

参考文献：

［1］Akane A，Matsubara K，Nakamura H，et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid ( DNA) from bloodstains，a major inhibitor of polymerase  chain reaction ( PCＲ) amplification［J］． J Forensic Sci， 1994，39( 2) : 362-372.

［2］Dong D，Yan A，Liu H，et al. Ｒemoval of humic substances from soil DNA using aluminium sulfate［J］． J Microbiol Methods，2006，66( 2) : 217-222.

［3］Wiedbrauk D L，Werner J C，Drevon A M，et al. Inhibition of PCＲ by aqueous andvitreous fluids［J］． Clin Microbiol， 1995，33( 10) : 2643-2646.

［4］ 刘小敏，唐恒锋，李文郎，等．高脂血、溶血标本对荧光定量聚合酶链反应测定低水平 HBV ‐ DNA 的影响［J］

．检验医学与临床， 2015，12( 21) : 3217-3218

［5］ 李金明．实时荧光 PCR 技术［M］．北京: 人民军医出版社，2014: 72

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编辑：青翠欲滴

审校：晨晨