含果糖的饮食是大鼠代谢综合征、近端肾小管损伤和尿石症危险因素

富含果糖的饮食是大鼠代谢综合征、近端肾小管损伤和尿石症的危险因素

  过量食用果糖（FR）会导致肥胖，代谢综合征（MS）和胰岛素抵抗，这是肾结石的已知危险因素。流行病学研究表明，果糖消费与尿石症之间存在关联，但确切的机制尚不清楚。雄性Wistar大鼠被分配到饮食中具有不同FR含量的三组8周：RD（n = 5） - FR为<3%的常规饮食;F10 （n = 6） - 常规饮食，在饮用水中加入10%的Fr;F60 （n = 5）—60% FR 作为固体食物。测定FR，肌酐（Cr），胰岛素（Ins），甘油三酯（Tg），同型半胱氨酸（HCS），尿酸（UA），钙（Ca），磷酸盐（Pi），镁（Mg）和钠（Na）的血清浓度。基于24小时尿液收集，进行了以下测试：尿液pH值，蛋白尿（PCR），N-乙酰基-（D）-葡萄糖氨酸酶（NAG）的排泄，单核细胞化学引诱蛋白（MCP-1），尿酸（uUAEx），磷酸盐（uPiEx），钙（uCaEx），镁（uMgEx）和钠（uNaEx）。计算肌酐清除率（CrCl）。

  使用苏木精和曙红（HE）和von Kossa染色剂检查肾脏切片中的钙沉积物。与RD日粮相比，F10和F60上的大鼠表现出较低的CrCl，较高的HCS水平以及MS的某些特征，如较高的Ins和TG水平。有趣的是，F10（液体）与F60（固体）饮食导致血清Ins水平升高。F10 和 F60 与 RD 相比，MCP-1 和 NAG 的排泄量较高，提示近端肾小管炎症性损伤。与RD相比，F10和F60显示出显着较低的uUAEx，尽管UA的清除率和排泄分数没有差异。F60 与 RD 诱导的严重磷酸尿 （>30×） 和钠尿症 （4×） 以及轻度钙尿的比较。F10 与 RD 诱导的钙尿 （3×）、磷尿 （2×） 和轻度钠尿的比较。小管内和间质中的磷酸钙结石仅在FR饮食的大鼠中分别在F10组的两只大鼠和F60组的另外两只大鼠中发现。发展为结石的大鼠的特征是血清胰岛素浓度显着升高，尿中钙和镁的排泄明显升高。富含果糖的饮食可能由于近端肾小管损伤和代谢综合征而促进钙结石的发展。

1. 引言

    果糖（FR）是一种天然存在于水果和蜂蜜中的单糖。其消费量在全球范围内急剧增加，主要是由于在食品和软饮料中添加了蔗糖（一种含有50%果糖和50%葡萄糖的双糖）和高果糖玉米糖浆（HFCS）。据估计，自1967年HFCS引入以来，美国的FR消费量增加了2000%[1]。今天，平均FR摄入量约为74g /天，是1700年代英国平均摄入量的25倍[2]。在欧洲国家也观察到类似的趋势，其中总糖消耗量占能量供应的15%至25%，与成人相比，儿童添加糖的摄入量相对较高[3]。在我们之前对一组2期和3期慢性肾脏病（CKD）患者的研究中，每日FR摄入量为59±22g，其中添加糖占63%[4]。

  FR的代谢与其他糖不同。由于缺乏负反馈，它在肝脏中通过果糖激酶迅速磷酸化为果糖-1-磷酸。因此，细胞内磷酸盐（P）和三磷酸腺苷（ATP）的消耗可以随着单磷酸腺苷（AMP）的进一步产生而短暂发生，然后代谢为一磷酸肌苷，最终代谢为尿酸（UA）[5]。短暂的ATP耗竭与缺血有一些相似之处，可导致蛋白质合成终止、氧化应激和炎症[6，7]。UA导致内皮一氧化氮（胰岛素作用的关键介质）水平降低，这反过来又会扰乱骨骼肌的血流和葡萄糖摄取，从而导致胰岛素抵抗和代谢综合征（MS）的发展[8]。

  临床和流行病学证据还表明，食用FR与肥胖[1]、胰腺β细胞功能障碍[9]、2型糖尿病[1，10]、痛风、高血压、慢性肾脏病和心血管疾病之间存在关联[11，12]。在发达国家，随着肥胖和糖尿病的流行，成人[13]和儿童肾结石病的发病率也在增加[14]。Taylor和Curhan的研究表明，在三大群患者中，添加糖的FR消耗与肾结石之间存在关联。根据半定量食物频率问卷调查，总游离FR摄入量最高的受试者与摄入量最低的受试者相比，肾结石的相对风险显著更高[15]。据推测，这种关联可能是由尿钙（uCaEx）[16]、尿酸[17]和草酸盐[18]的排泄增加或诱导胰岛素抵抗引起的，这与尿液pH值低和尿酸盐沉淀有关[19]。作为结晶抑制剂的镁（Mg）和柠檬酸盐含量低，以及西方饮食中纤维含量低，加上加工食品，也可以促进肾脏和尿路结石的形成[16，20]。在肥胖、代谢综合征和 2 型糖尿病患者中，肾结石的患病率较高。同时，草酸钙结石形成的风险随着MS特征的数量而增加[21]。

  FR作为尿石症的致病因素的作用仍然令人费解。一方面，流行病学和临床研究表明，FR可能是导致这种疾病的原因，而另一方面，对于肾结石患者，仍建议在饮食中食用水果和果汁[22]。据我们所知，迄今为止进行的研究尚未直接证实FR饮食与肾结石存在之间的关系。因此，我们利用FR含量及其形式（液体与固体）不同的饮食方案来评估MS的肾小管功能和标志物。已利用实验模型对肾结石进行同步组织病理学评估。

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2. 结果

营养、代谢状况的评估

  与RD相比，F10和F60日粮大鼠血清FR浓度趋于较高，F10组最高。这可能表明液体形式的FR比固体形式更容易从胃肠道吸收。在实验结束时，大鼠每天的总卡路里摄入量没有差异，尽管F10和F60饮食的动物比RD组的动物消耗的少得多。这可能是由于以FR的形式消耗的卡路里比例更高。F60饮食中的大鼠体重增加显着降低，这可能表明其毒性潜力。在富含果糖的饮食中，血清中白蛋白浓度也有降低的趋势。与F10相比，F60中的肌酐浓度较低，因为实验结束时动物的体重较低。与RD组相比，F10和F60饮食的大鼠显示出肌酐清除率较低的趋势。在富含果糖的饮食八周后，大鼠表现出代谢综合征的一些特征，即血清甘油三酯，胰岛素浓度较高，胰岛素的稳态模型评估（HOMA）得分较高。有趣的是，与F60（固体）相比，F10饮食（液体）导致血清中的胰岛素浓度更高。血清中UA水平无差异。同型半胱氨酸（HCS）水平随着饮食中FR含量的升高而显着增加。与RD相比，在F10和F60中观察到促红细胞生成素（EPO）水平升高的趋势。尽管在富含果糖的饮食中，磷酸盐水平（Pi）和磷酸钙产物（CaxPi）较高趋势，但血清钠（Na）、钾（K）、镁（Mg）和钙（Ca）浓度没有显著差异（表 1).

  尿素氮 - 血尿素氮;CaxPi—磷酸钙×产物;HCS—同型半胱氨酸;HOMA—胰岛素抵抗的稳态模型评估;NS — 无统计学意义;PTH-甲状旁腺激素;FGF-23—成纤维细胞生长因子23;NS - 不具有统计显著性。

尿液的评估

  来自F10组的大鼠将FR作为10%的水溶液，倾向于喝更多的水，产生的尿液是RD和F60组大鼠的两倍。随着饮食中FR含量的增加，尿液pH值降低（表示酸度较高），与RD组和F10组相比，F60组的pH值显着降低。然而，比重随着饮食中FR含量的增加而增加，并且在F60组中显着更高。两组之间的蛋白尿无差异。随着饮食中FR含量的增加，单核细胞化学引诱蛋白-1（MCP-1）和N-乙酰基-ß-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的尿排泄显着增加。尿尿酸排泄（uUAEx）随饮食中FR含量的增加而降低，与RD相比，F10和F60组显着降低。然而，尿酸清除率（UACl）和尿酸排泄分数（UAFEx）的水平在两组之间没有差异。富含FR的饮食导致尿清除率显着提高，以及磷，钠和钙的总排泄和分次排泄。F60饮食与磷酸盐（>30×）和钠尿症（4×）增加有关，并且在较小程度上与钙尿增加有关。另一方面，F10饮食主要导致钙尿增加（3×），并且在较小程度上导致磷尿和钠尿增加。两组间钾、镁排泄与尿液无统计学差异（表 2).

  uCaEx-尿钙排泄;氯化钙—钙清除率;CaFEx-钙分数排泄;尿素利用化合物—尿酸清除率;uUAEx - 尿尿酸排泄;UAFEx-尿酸分馏排泄;尿钠 - 尿钠排泄;NaCl—钠清除率;NaFEx-钠分数排泄;uPiEx—尿磷酸盐排泄;PiCl—磷酸盐清除率;PiFEx—磷酸盐分馏排泄;uMgEx-尿镁排泄;氯化镁-镁清除率;MgFEx-镁分数排泄;uKEx-尿钾排泄;KCl—钾清除率;KFEx-钾分次排泄;MCP-1 / Cr-尿单核细胞化学引诱蛋白-1每尿肌酐比值;NAG/肌酐比值—尿N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖酶/尿肌酐比值;PCR—尿蛋白与肌酐比值;NS - 不具有统计显著性。尿液电解质排泄占膳食摄入的百分比分析.由于与RD和F10组使用的饮食相比，F60饮食的组成存在差异，因此对每种饮食中提供的钠，钙和磷酸盐的量进行了比较分析。与RD相比，饮食中饮食中的钠摄入量在F10中低20%，在F60中高出20%，在F10中，饮食中的钙和磷酸盐摄入量在F10中比RD低30%。与此同时，与RD相比，F60中的钙含量降低了60%，磷酸盐含量减少了30%。还计算了尿电解质（钠，钙，磷酸盐）排泄占膳食摄入量的百分比（表 3).

肾脏组织病理学

  肾脏标本的显微镜检查显示，F10组的两只动物和F60组的另外两只动物存在局灶性间质和肾小管嗜碱性沉积物（磷酸钙结石）。结石位于肾病的所有部位的皮质和肾髓质中。在黄曲霉素和曙红（HE）染色的组织切片中，凝结物不可极化，小，圆形，表现出具有同心环的psamoma体样子结构（图 1,图 2,图 3和图 4).Von Kossa染色显示棕黑色钙化。此外，光学显微镜检查显示F10和F60组大鼠的局灶性和轻度肾小管间质淋巴细胞浸润（图 5和图 6).RD组大鼠肾上无急性肾小管损伤、炎症或钙沉积的形态学特征（图 7).

3. 讨论     

  我们的研究证实，FR摄入导致MS的一些特征的发展，如血清胰岛素，HOMA和甘油三酯水平的增加。FR 还诱发由 MCP-1 介导的局部炎症反应，导致肾近端肾小管损伤，其表现为 NAG 排泄增加和肾实质中存在单核细胞浸润（图 5和图 6).有趣的是，我们的研究还证实，与固体饲料（F60）相比，以液体（F10）形式给予的FR导致血清中的胰岛素浓度更高。这可能是因为F10比F60更热衷于动物消费（表 1).在我们之前对同一组大鼠进行的研究中，我们发现F10与F60相比刺激胰岛细胞分泌更高的胰岛素和C肽，并导致更明显的胰岛素抵抗[9]。此外，我们的研究表明，作为10%液体溶液给予的FR显着增加了uCaEx并减少了uUAEx，而以固体60%进料的形式，它进一步降低了uUAEx，导致尿液酸化并诱导严重的uPiEx（表 2).      

  本研究的一项重要观察结果是显微镜下证实，仅在高果糖饮食的大鼠中，仅在高果糖饮食的大鼠中，分别在F10（图 1和图 2） 和 F60 组中的另外两个 （图 3和图 4).基于组织病理学分析（HE和von Kossa染色），我们假设这些凝结物可以由磷酸钙（图 1,图 2,图 3和图 4).来自F10和F60组的结石形成大鼠的特征在于血清胰岛素浓度显着升高，CaCl增加，以及uCaEx，CaFEx增加，有趣的是，uMgEx（表 4).有趣的是，由于与F60大鼠相比，F10大鼠排泄的低比重尿液是其两倍，我们的研究结果表明，尽管尿液饱和度过高，但FR还会引起其他特定的代谢紊乱，导致岩石发生。 肾脏中常见的结晶钙盐是磷酸钙（CaPi）和草酸钙（CaOx）[22]，后者可以在UA晶体的基础上形成[19]。 据认为，高尿pH值有利于磷酸钙（CaPi）结晶，而低或中性pH值则促进草酸钙（CaOx）的沉淀[23]。 动物模型研究表明，管腔内肾钙质沉着症是多种化合物（包括CaPi、CaOx和UA）尿过饱和的结果，而间质性肾钙质沉着症与炎症和结晶不良CaPi的沉积有关[24]。 此外， CaPi 晶体可以在肾小管中沉淀，并通过肾间质向外延伸至肾，促进 CaOx 结石的结晶 [ 23 ] 。

果糖诱导的代谢综合征和炎症

  一项大鼠模型证实，果糖强化饮食5周可能诱发完全性MS，包括高血压、高胰岛素血症、高甘油三酯血症和高同型半胱氨酸血症[25]。HCS通过激活核因子-kappa B（NF-κB）刺激肾近端肾小管细胞中MCP-1的表达，并可能有助于慢性肾脏疾病的进展[26]。 我们发现，血清HCS浓度和MCP-1和NAG的尿液排泄随着饮食中FR含量的增加而增加，与RD组相比，F60组达到统计学意义（表 2).虽然富含FR的饮食对炎症标志物和近端肾小管损伤的影响与饮食中的FR含量成正比，但建议毒性作用可能取决于肾小管液中的FR浓度。还证实FR增加近端肾小管细胞中UA的细胞内水平，这进一步诱导炎症反应[27]。同样，在对以液体溶液形式接受250g/L FR治疗16个月的大鼠与葡萄糖和蔗糖饮食相比进行的研究中，已经确定肾小管和肾小球的炎症损伤与尿液中的FR浓度成正比[28]。此外，摄入10% FR持续8周可诱发大鼠肾小血管疾病和肾小球高血压[12]，而含有60%FR的饮食与正常或葡萄糖饮食相比，引起大鼠肾小管间质损伤和间质巨噬细胞浸润[29，30]。 

  事实上，我们发现与RD组相比，F10组和F60组的EPO浓度较高，这可能是继发于炎症或缺血的小管间质损伤的标志[31]。同时，显微镜检查证实F10和F60大鼠均显示肾小管间室内存在局灶性淋巴细胞浸润（图 5和图 6).然而，8周的FR饮食不足以在F10，F60和RD组之间产生肌酐清除率（CrCl）的显着变化（表 1).毫无疑问，延长富含果糖的饮食期会导致更严重的肾损伤。 胰岛素抵抗通过降低尿pH值在肾脏水平起作用，从而阻碍了肾脏响应酸负荷产生肾铵的能力[32]。此外，胰岛素抵抗的特征是可滴定酸（例如磷酸盐和硫酸盐）的排泄增加以及尿中柠檬酸盐浓度低[19]。其他作者还报告了果糖喂养大鼠的uUAEx较低[31，33]。在以10%FR饮食喂养的大鼠中，这种现象可能依赖于继发于高胰岛素血症、血脂异常和炎症的近端肾小管中尿酸盐转运蛋白的异常表达[33]。

  此外，富含果糖的饮食持续3个月不会导致血清UA浓度的显著差异，最终将饮食延长至5个月会导致显著的高尿酸血症[17]。还被认为，FR不会显着增加大鼠的尿酸水平，因为尿酸酶的存在导致尿酸降解[10]。与前面提到的研究类似，与RD组相比，F10组和F60组的uUAEx显着降低，尽管血清中UA的浓度没有显着差异，UACl和UAFEx（表 1和表 2).此外，MS患者还具有uCaEx增加的特征，并且此类患者中钙结石形成的风险与MS的特征数量成正比[21]。这些因素可能易发生尿酸和钙结石的形成，因为低尿pH值和低尿量都是UA沉淀的已知危险因素[32]。

果糖对宏观矿物稳态的影响

  我们的研究证实，FR饮食对常量矿物质稳态产生负面影响，导致uCaEx以及uPiEx和uNaEx相对于其膳食摄入量（表 3).同样的观察结果也出现在人类身上[34]。虽然我们没有发现血清钙（Ca）水平有显着差异，但与RD组和F60组相比，F10组的uCaEx显着更高。然而，在F60组中，uCaEx比F10组小两倍，并且仅与RD组相比显着高（表 2).这一事实与饮食无关，因为与RD组相比，F10和F60组大鼠消耗的Ca含量显着降低。同时，F10和F60组从饮食中消耗的每CaEx的uCaEx比率显着高于RD组（表 3). 由于钠氢交换器3（NHE3）负责反式上皮钠通量，高达60%的过滤Ca被重新吸收在近端小管中，从而为水通量提供渗透驱动力和被动旁细胞旁Ca通量的驱动力[35]。NHE3也已知受钙质激素调节，即PTH [36]和1，25-二羟基维生素D 3  [ [37].已经证实，uCaEx的增加是包括葡萄糖和蔗糖在内的所有糖的特征[38]。 与葡萄糖相比，FR饮食可以将大鼠肾脏匀浆中的Ca含量增加多达8倍，但只有在饮食中缺乏镁时[16]。我们没有发现血清Mg或uMgEx在组的基线特征（表 1和表 2).虽然，FR饮食中的结石大鼠的特征在于uMgEx明显高于FR日粮上没有肾脏沉积物的大鼠在显微镜下（表 4).

  众所周知，Mg可以抑制岩石发生，因为它可以与草酸盐结合[39]，并且它与Ca离子竞争，与草酸盐复合物，草酸盐比CaOx更易溶[40]。也有报道称，镁治疗对肾结石的任何有益作用均不可信[41]。另一方面，FR饮食中Mg缺乏的大鼠已经发展为由CaPi而不是CaOx沉积引起的肾钙质沉着症[16]。因此，Mg对CaPi肾结石发展的影响可能是有限的。由于技术问题，我们没有测量尿液中的草酸盐排泄，因此不能排除其在该实验中钙沉积物形成中的作用。 同时，在我们的研究中，uPiEx和uNaEx随着饮食中的FR含量而增加。与RD组相比，F10组的uPiEx大两倍，F60组的uPiEx高出三十倍以上（表 2).然而，与F10和RD组相比，F60组仅观察到血清Pi浓度较高的趋势（表 1).与RD组相比，F10和F60组中的大鼠从饮食中消耗的Pi减少了约30%。

  尽管如此，饮食中消耗的uPiEx与Pi的比例严重升高，特别是在F60大鼠（表 3).其他研究还证实，与葡萄糖[42]和淀粉[35]相比，膳食FR导致大鼠的uPiEx更高[42]。此外，一项关于喂养63%FR的大鼠的研究证实，股骨和胫骨中Ca和Pi含量显著降低[43]。因此，富含FR的饮食也导致Pi平衡为负，继发于血清碱性磷酸酶活性增加和uPiEx升高[35]。研究表明，60-70%的过滤Pi在近端肾小管中被重新吸收[44]。Pi重吸收主要通过控制少数类型位于肾近端小管中的磷酸钠共转运蛋白（NaPi）的顶端表达来实现，并受PTH、维生素D和膳食Pi调节[37]。 为了了解钙和磷排泄增加的机制，测量了PTH，FGF-23和25（OH）-维生素D3（D3）的浓度。各组间分析参数无统计学意义差异。虽然，与RD组相比，F10和F60组的PTH浓度较高，D3水平较低（表 1).因此，我们的实验结果可能表明与高果糖饮食相关的肾小管损伤。 有趣的是，一项探索健康男性每天摄入200g FR持续两周的效果的研究也证实了PTH浓度增加和血清离子钙降低[45]。 同时，对用FR喂养四周的大鼠进行的另一项研究表明，由于1α-羟化酶活性降低，肠道和肾脏中钙重吸收的继发性抑制，循环水平降低1，25-（OH）2D3。 

  有趣的是，这些动物也患上了骨质疏松症[46]。 果糖诱导的肾小管间质损伤可能与活性维生素 D3 的继发性缺乏和 PTH 产生紊乱有关。这些异常最终可能是CKD进展的原因，并对骨骼产生不利影响。因此，果糖成为不仅导致当今心血管疾病流行的罪魁祸首，而且还导致肾结石和骨质疏松症。 最后，我们想提一下当前研究的一些局限性。与F10和RD组相比，F60组的饮食组成在蛋白质，脂肪，维生素D和矿物质含量方面除果糖外不同。这种饲料的选择取决于它是唯一一种果糖含量为60%的市售日粮。

  由于F60饮食的组成会影响尿液中钙和磷酸盐排泄的结果，因此在实验过程中分析了动物消耗的食物和矿物质的量。应评估草酸盐和柠檬酸盐的尿液排泄，因为文献中的数据表明，FR 饮食和代谢综合征可能与尿液中草酸盐排泄增加和尿枸橼酸盐排泄减少有关。本研究是在一小群雄性大鼠上进行的。由于性激素可能会影响尿液成分，因此FR饮食的影响也应该在雌性大鼠中得到证实。在组织制备过程中使用不冲洗掉任何尿酸晶体的技术进行组织病理学评估也是合适的。应用X射线衍射分析技术对腔内和间质沉积物进行精确表征将为本研究增加非常有价值的信息。 尽管存在这些缺点，但我们认为这项研究的初步结果提供了有价值的信息，因为它们首次证实了高FR饮食与肾小管中沉淀钙沉积物和肾实质中存在的直接关系，并通过显微镜检查证实了这一点。

4. 材料和方法

动物模型

  所有动物程序均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行，并得到比得哥什动物福利机构委员会（第13/2007号和第22/2011号）的批准，符合《波兰动物实验法》（Journal of Laws 2005/33/289）和欧洲议会第2003/65/EC号指令。波兰科学院，波兰华沙。这些动物的初始体重为386±40克，在实验开始时年龄为八周。他们被随机分配到三组，并在以下饮食中保持八周：RD（n = 5）常规饮食，FR浓度<3%，以颗粒状食物的形式给予（波兰Agropol）;F10（n = 6），由常规饮食组成，在饮用水中补充10%的FR溶液（Biofan Fruktoza，波兰）;和F60（n = 5），由60%的FR组成，以颗粒状食物的形式（TD.89247，Harlan Tekland，剑桥，威斯康星州，美国）。RD饮食含有16%的蛋白质，2.8%的脂肪，1.10%的钙，0.7%的磷，0.22%的钠和800 IU / kg的维生素D3。F60饮食含有18.3%的蛋白质，5.2%的脂肪，0.6%的钙，0.54%的磷，0.49%的钠，500 IU / kg的维生素D3。

  将动物保持在恒定的12小时光周期下，温度在21°C至23°C之间。他们被允许免费获得水和食物。计算每日能量摄入。在实验开始和结束时测量体重。此外，在研究结束时，进行了24小时的尿液收集，并使用个体化代谢笼收集样本。然后处死大鼠，并在禁食4小时后从心脏右心室收集血液样本进行生化分析。收集尿液和血清并将其储存在-80°C，然后进一步分析。

实验室检验

5. 结论

  总之，我们发现膳食果糖消耗与近端肾小管代谢综合征表型和局部炎症反应（MCP-1）的诱导有关。即使在饮食中果糖含量低至10%时，也可以观察到近端肾小管的缺陷。而60%果糖饮食对肾小管功能的毒性作用更大。这些干扰导致尿酸排泄缺陷，以及高钙尿和高磷尿的诱导。因此，果糖诱导的代谢综合征以及尿液与矿物盐的过饱和性导致钙盐在肾小管中沉淀，而并发炎症易导致间质性肾钙质沉着症。这项工作的一个有趣的观察结果是，基于液体10%FR溶液或固体60%FR饲料，两种测试的高果糖饮食，为期8周，能够在以高胰岛素水平和高钙尿症为特征的大鼠中诱导尿石症。果糖诱导的小管间质损伤可能与活性维生素 D3 的继发性缺乏和 PTH 产生紊乱有关。

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