张锋团队赢得的CRISPR基因编辑关键专利，其在病原诊断上有何应用？|《临床实验室》

图1 由gRNA介导的CRISPR-Cas9系统靶向基因编辑作用机制示意图[3]

CRISPR/Cas系统：规律成簇间隔短回文重复序列 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。而Cas基因(CRISPR-associated genes)则是一类在CRISPR位点附近高度保守的基因家族，通过该基因家族编码的蛋白复合体具有多种RNA结合蛋白特性的结构域，以及核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等多种酶活性特征。近年来一系列的研究发现，Cas基因可以与CRISPR序列协同作用，Cas蛋白复合体在特定向导RNA（gRNA）介导下，赋予了细菌和古细菌对病毒的获得性免疫功能，而间隔序列在其中发挥编码引导Cas蛋白定位的向导RNA的功能，如图1。

▶ 根据核糖核蛋白复合物特性及发挥功能方式，目前CRISPR/Cas基因编辑系统可以分为两大类别，6种型别和多种亚型：以多个Cas组成的效应复合体行使功能为特征的第1类CRISPR/Cas系统；以单个多结构域Cas为基础构成的第2类CRISPR/Cas系统。由于第2种类型CRISPR/Cas系统操作简单高效，是目前最为常用的基因编辑系统，以Cas9，Cas12a和Cas13a等为代表性。  （ 作者：陈威震） 

2016年张锋团队 首次发现 了一种能够靶向结合和降解RNA的酶C2c2（即Cas13a），并发现了Cas13a还具有不依赖于核酸序列的反式切割（trans-cleavage）或附带切割（collateral effect）效应 [10] 。 

• 所谓反式切割活性，即Cas13a在与crRNA和靶标核酸形成切割三元复合体之后，能够对系统内存在的任意序列ssRNA进行切割。 

随后在2016年9月，Jennifer Doudna等人率先将CRISPR/Cas13a蛋白的附带切割活性 用于检测RNA [11] ，但是该团队开发的检测方法灵敏度低，临床应用潜能有限。 

紧接着在2017年，James J. Collins团队和张锋团队合作，通过利用CRISPR/Cas13a的“反式切割”功能，开发了一种 高效的体外核酸检测方法 —SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），已用于寨卡病毒、登革病毒等病原体核酸检测和DNA突变鉴定等 [12] 。 

基于CRISPR/Cas基因编辑技术的分子诊断应用与研究立即驶入快车道，并取得系列重要成果。 

之后研究团队对SHERLOCK检测系统进行进一步优化，在系统中通过增加Cas蛋白的种类（LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a）以达到 可以同时检测四种病毒（或靶标） 的目的 ，并利用Csm6酶放大其最终检测信号，进一步增强该方法的灵敏度 [13] 。 

在进一步优化的SHERLOCK检测系统（SHERLOCKv2）中，其性能方面有了更大提升， 能够实现单管多靶标检测出，定量检测限可低至2 Amol/L 。由于该检测体系检测 快速、价格低廉、灵敏度高 ，因此非常适用于POCT分子诊断产品研发与应用。 

2018 年，Jennifer Doudna等人发现Cas12在gRNA引导下特异性结合和切割靶标双链DNA后，会产生类似于Cas13a的反式切割（附带切割）效应，但是其切割靶标为非特异性单链DNA（ssDNA） [14] 。根据此特性，研究人员相继开发基于Cas12反式切割活性的 DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）[14] 和 HOLMES（an one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System）[15] 等核酸检测系统。 

由于DETECTR或HOLMES检测系统中Cas12识别靶标为双链DNA，因此 省去了体外将DNA转录成RNA 这一繁琐步骤，诊断过程进一步简化。 

【参考文献】

[3] Charpentier E, Doudna JA. Rewriting a genome. Nature. 2013;495:50-1.

[10] Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016;353.

[11] East-Seletsky A, O’Connell MR, Knight SC, Burstein D, Cate JH, Tjian R, et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection. Nature. 2016;538:270-3.

[12] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356:438-42.

[13] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360:439-44.

[14] Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018;360:436-9.

[15] Li S-Y, Cheng Q-X, Wang J-M, Li X-Y, Zhang Z-L, Gao S, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell discovery. 2018;4:1-4.

-End-   

编辑 | 骆秉涵 王迪  

原文以 《CRISPR/Cas基因编辑技术在病原诊断中的应用》为 题 发表在《临床实验室》杂志2022年3月刊专题“POCT分子诊断”实验室诊断技术导航版块 

✍ 版权归《临床实验室》杂志所有，未经允许，禁止随意转载！