还会盲目用药 ? 著名期刊发文证实乙肝一线药物替诺福韦耐药

本期分享一篇于2019年2月收录在Journal of Hepatology (IF 18.946, 2018年)的文章 ——Identificationof a quadruple mutation that confers tenofovir resistance in chronic hepatitisB patients（慢性替诺乙型肝炎患者福韦耐药相关四突变的鉴定）。

文章报道了2例慢性乙肝患者在服用替诺福韦（TDF）单药以及联合拉米夫定（LAM）/恩替卡韦（ETV）/替比夫定（LdT）期间产生表型耐药(病毒学突破/反弹）。研究者通过HBV病毒P区的突变检测并进行体外假病毒合成转染肝细胞培养药敏实验，发现四种突变组合CYEI与TDF的耐药有关。

①研究背景、方法

（1）2名患者用药史、耐药检测情况及载量信息

患者A：（图1A）57岁，女性，初诊为慢性乙型肝炎患者。2007年开始服用LAM(100 mg/d)治疗。2009年8月发生病毒学突破，并发现LAM耐药突变（rtL80I)，加ADV（10mg/d）治疗。2012年12月又发生病毒突破，sanger测序发现新突变（rtM204I），抗病毒治疗方案改为LAM(100 mg/d)+TDF(300mg/d)。2014年2月再次病毒学突破，且在原来突变（rtL80I+rtM204I）的基础上又发现新的突变rtA181T，此时，治疗方案改为ETV(1 mg/d)+TDF(300mg/d)。经过14个月ETV/TDF治疗，再次发展至病毒学突破，载量达到4.35×107 IU/mL。2015年7月，采集血液样本用于本研究，HBV DNA水平为1.74×107 IU/mL。

患者B：(图1B)66岁，男性。慢性乙型肝炎患者。2006年1月至12月，接受LAM治疗1年。2007年6月因HBeAg阳性，改用ETV(0.5 mg/d)治疗，在2009年5月时出现ETV耐药。2009年6月至2012年7月，改用ADV(10mg/d)+LAM（(100 mg/d)）联合治疗。2012年7月又发生病毒学突破，治疗方案改为TDF (300 mg/d)+LdT(600 mg/d)联合治疗。2013年9月随访丢失。直到2014年6月，患者开始接受TDF单药治疗，病毒完全被抑制。2017年6月，再次发生病毒学突破，血清HBV DNA为6.94×106IU/mL。本研究所用的血液样本为该时间抽取。该患者于2017年9月死于肝癌。由于该患者主要在当地的私人诊所接受治疗，没有具体的抗病毒药物耐药突变检测结果。

（2） 研究方法 研究者采集这2例患者服用TDF（单药或联合其他药物）后发生病毒学突破的血液进行测序，鉴定HBV突变情况；接着，他们分离病人HBV不同病毒株克隆进行药敏分析，评估和筛选可能与TDF耐药相关的突变；然后，对筛选出来的突变人工合成不同突变组合的克隆，最后通过药物实验分析找出与TDF耐药最相关的突变。

②主要结果

（1）从TDF耐药病例分离HBV聚合酶RT区的突变谱

患者A在服用含TDF的抗病毒药物后发生病毒学突破，抽取此时血清获取HBV的DNA，构建含病人HBV rt区的HBV1.2mers载体，得到8个克隆（克隆1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、1-7、1-8和1-13），测序分析每个克隆整个RT基因的准种。 结果显示：8个克隆中，有4个克隆的RT区序列相同，表明优势HBV克隆已经突变（表1）。

（2）来源于患者的RT基因突变与TDF耐药相关

为了评估从患者分离培养病毒株的突变与TDF耐药的关系，本研究对典型的突变体（1-1和1-13）进行了体外药敏实验。分别将野生型、1-1和1-13的HBV1.2mers转入huh7细胞，随后进行细胞复制能力和药物敏感性的测验。southern结果显示（图2A）：在一定浓度TDF作用下，野生型的复制大大降低，表明野生型对TDF敏感，而1-1和1-13克隆的复制并未显著降低，HBsAg和HBeAg的水平也无明显变化，表明1-1和1-13克隆对TDF不敏感。荧光定量PCR结果（图2B）显示IC50值，克隆1-1（91.8±0.2μM）和克隆1-13（92.2±0.3μM）比野生型（3.8±0.6μM）高24倍多，表明克隆1-1和1-13对TDF有很强的耐药作用。

（3）CYEI四突变与TDF耐药相关

为了鉴定克隆1-1和1-13的突变特征，本研究通过定点突变构建了11个含有上述7个共同突变不同组合的克隆（C、E、CY、CE、YE、CYE、CYEI、MV、CYEMV、CYELMV和CYELMVI）。转染肝细胞并进行药物处理分析。从Southern blot结果来看（图3B）：C, E, CY, CE, YE和MV对TDF敏感，CYE对TDF敏感性显著降低，而且，CYE加上rtL269I（I）后，其复制能力也明显增强，并出现表型耐药。

实时荧光定量PCR（图3C）结果显示： CYE突变的IC50值是野生型的3.7倍，CYEI突变的IC50值是野生型的15.3倍；CYE的IC90 值是野生型的6.2倍，CYEI的是野生型的26.3倍。此外，恩替卡韦耐药突变LMV加上CYEI后，能增强LMV对TDF的耐药。

为了比较不同突变的复制能力和耐药的效果，用实时PCR数据绘制了抗性倍数（IC50和IC90）与相对复制关系图（图4DE）。结果显示：CYE加上I后病毒复制能力及TDF耐药大大增强，CY加E后会强烈抑制复制，但增加L或I突变后增强复制，意味着这些突变发挥着CYE的补偿性突变的作用。

（4）突变对其他抗病毒药物的药敏测试

ETV：野生型和CYE或CYEI病毒突变对ETV敏感，但CYELMVI突变对ETV和ETV/TDF联用强耐药（IC50=4.37μM）。 克隆1-1因含有CYEI和其他突变（rtL80I+rtM204I+rtQ267L），对ETV单药（IC50=1.22 μM）及ETV/TDF联用均耐药，且比克隆1-13的复制能力更高。 这些结果可以解释病人A在ETV/TDF联合治疗期间发生病毒学突破后，克隆1-1成为优势克隆的原因。 NVR3-778：所有的TDF耐药突变（无论是否同时含有ETV耐药突变）对衣壳组装调节剂NVR3-778均敏感，敏感性和野生型相近(IC50=0.44 μM)。

③ 文章结论 本研究鉴定了2例TDF临床耐药的乙肝病人血清中一种四重TDF耐药突变，并在体外验证其对TDF耐药。据我们所知，这是首次从临床和体外方面报道HBV TDF耐药突变，CYE三突变降低了TDF的敏感性，CYEI四突变对TDF完全耐药。CYEI+LMV增强HBV复制能力，且对ETV和TDF+ETV耐药。CYEI（±MLV）突变以及对TDF耐药的HBV突变病毒株对NVR3-778敏感。

④延伸与思考

（1） 目前研究的大部分乙肝病人都使用过多种药物，初治开始就只使用TDF单药治疗的病例还很少，且随访时间也不够长，所以TDF单药耐药的证据还不十分充足，针对耐多药HBV菌株的临床指南也很有限。 但由于HBV DNA高复制的特点且缺乏酶校正功能，使得HBV碱基突变频率高，因此使用NAs治疗乙肝，包括TDF，都有发展为耐药的风险，尤其是在耐多药HBV菌株中耐药更容易发生。

（2）近几年，关于TDF不敏感的研究相继被报道，地坛医院就明确报道了TDF有耐药，且越来越多新发现的突变被证实与TDF耐药有关。 因此，临床上一旦出现服用TDF效果不佳的案例要特别关注，了解病人用药史和依从性，及时进行P区DNA测序，以了解患者体内病毒变异情况，选择合理的治疗方案。

（3）ETV和TDF是乙肝抗病毒治疗一线药物，效果好，但针对每一位患者，这两种药怎么选？如果都耐药了，患者该怎么办？ 文献中的病例B纯经验用药，用药混乱无明显依据，最终死亡；病例A在发生病毒学突破后进行耐药检测，并据

此更换治疗方案，但遗憾的是该患者在长期的抗病毒治疗过程中对LAM、ETV和TDF均已耐药，已无更有效的药物可用。 如果患者在初治时先进行耐药检测，制定最佳的治疗方案、疗过程中实时耐药监测、治疗不佳时及时耐药检测突变情况，更换更合适的方案，或许可以避免或减缓耐药的发生，为患者争取更好的治疗机会。 正因为药物的选择不多，用药更需谨慎。