国际著名期刊发表TDF-ETV联合治疗期间HBV病毒耐药​

当前，不论国内和国外，恩替卡韦（ETV）和富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）均为乙肝患者进行核苷（酸）类似物抗病毒治疗的一线药物，这2种药物均是强效低耐药药物，安全性好。在TDF几年的随访实验追踪过程，临床上未发现耐药案例。

那么，乙肝患者长期服用TDF真的不会发生耐药或不敏感事件吗？

本期给大家分享一篇于2017年发表在Journal of Hepatology (IF 15.04, 2018年)的文章 ——Selection of the highly replicative and multidrug resistantrtS78T HBV polymerase mutation during TDF-ETV combination therapy（TDF-ETV联合治疗期间HBV病毒P区rtS78T位点突变导致多重耐药的产生和病毒复制能力增强）。

文章报道了2例乙肝患者在服用ETV、TDF单药以及联合用药期间，产生了表型耐药(病毒学反弹或低次方居高不下和ALT升高)的现象。通过HBV病毒P区的突变检测并进行体外假病毒合成转染肝细胞培养药敏实验，研究者发现2例患者的rtS78T / sC69 *突变与病毒复制能力增强和抗病毒治疗应答不足相关。

①研究方法、背景  

本文带您回顾这篇文章的主要内容。

研究人员发现2例患者在医院就诊期间，使用ETV、TDF单药和联合治疗后仍然出现抗病毒治疗不佳的情况，其中1例患者死于侵袭性肝细胞癌。 他们将不同时间点采集这2例患者的血液进行测序，鉴定HBV突变情况。接着，他们利用具有复制能力的乙肝病毒载体在体外瞬时转染肝癌细胞，进行功能分析，评估体外合成的假病毒的复制的效率及对抗病毒药物的抗性和对HBV分泌物质（病毒颗粒，外泌体）的潜在影响。

②主要结果

2名患者抗病毒治疗不佳的HBV DNA水平和ALT水平

患者A： 2009年8月，一名53岁的高加索人，男性，初诊为慢性HBeAg阴性HBV患者，HBV病毒载量基线为6×105 Copies/ml。在最初的检查中，肝活检显示为2级炎症和早期纤维化（1级），但同时存在一个可疑的肝细胞癌IV段、大小约3.4 cm的肝结节。症状经组织学证实确实为HCC并完全切除(R0)后，该患者立即进行了TDF初始治疗。

21个月后，经qPCR检测，HBV DNA降低到检测不到的水平(<34copies/ml)；患者定期(3-6个月)随访HBV抑制水平和并进行HCC监测。

2012年3月，大约2.5年后，HBV病毒载量增加，患者进行TDF和ETV联合治疗，但抑制HBV复制作用不明显。

2012年6月，大约3个月后，患者再次诊断为HCC，需要进行右半肝切除手术。不幸的是，肝细胞癌在组织学上是多灶性的，癌细胞伴有血管浸润、形成门静脉血栓。

2013年4月，患者因晚期肿瘤去世。该名患者在ETV/TDF联合治疗期间，HBV DNA呈低水平阳性(见下图)

研究者收集患者在TDF治疗期间HBV病毒载量上升后(开始TDF治疗后30个月和37个月)两个时间点的血液样本并进行分析。

患者B： 2008年1月，41岁亚洲妇女，HBeAg阳性，高病毒载量2×109 Copies/ml。肝活检显示中度炎症(1-2级)、早期纤维化(1期)，ALT水平重复检测均高于正常上限患者。患者接受ETV进行初始治疗，ETV治疗期间，病毒载量只是缓慢下降(治疗18个月后，病毒载量850 Copies/ml)。

2009年11月，研究者检测到患者病毒载量增加了约1 log值，于是对其进行ETV和TDF联合治疗。然而，即使是双重抗病毒治疗也不能完全抑制该患者HBV DNA水平。超声检测结果显示，患者没有HCC的进展。研究者收集患者ETV治疗48和57个月的血液样本，并进行分析。

2013年，患者自行停药，病毒载量再次增高。

2名患者HBV病毒P区测序检测出rtS78T和sC69*突变

研究者对A和B患者的2个时间点的血液样本进深度测序分析，发现2名患者在2个时间点均检测出HBV聚合酶区rtS78T点突变，该突变引起HBV病毒的前S区sC69位置产生了提前终止密码子，从而导致几乎整个small HBV表面蛋白缺失。

其中患者A：首次采集的血液样本测序结果显示，发生rtS78T突变和sC69*突变病毒株比率分别为93.05%和93.22%。而第二次采集的血液样本（6个月后）检测结果显示，发生rtS78T 和sC69*突变病毒株的比率为100%。

患者B：首次检测时rtS78T的比率为13.96%，sC69*为14.21%，8个月后rtS78T的比率分别为38.16%，sC69*为37.78%。

2个患者前后2次采集的血样P区测序检测结果比较显示，rtS78T突变和sC69*在患者体内的比率均有明显提升。同时，患者B的2个时间点血液检测样本中检测出HBV的PreS1和Pres2连接处一段261bp编码氨基酸的碱基缺失（nt 1124 to 1385）。

rtS78T/sC69*和preS1/preS2del对病毒复制和分泌的功能影响

为了进一步验证rtS78T/ sC69*、preS1/S2缺失与患者体内HBV药物敏感度降低的关系，研究人员在体外构建了含有rtS78T/ sC69*、preS1/S2突变三种不同形式组合的假HBV病毒，分别命名为M1（只含rtS78T/sC69* 突变HBV）、M2（只含preS1/S2缺失HBV）、M3（rtS78T/sC69*+preS1/S2缺失）

他们将这些合成的3种HBV病毒和无上述突变的野生型的HBV病毒（WT）体外瞬时转染Huh7人肝癌细胞。体外转染实验显示：M1和M3在HBeAg表达量水平，HBV RNA(pg RNA和 pre core RNA)水平，HBV pg RNA水平，GFP表达水平均高于WT；而M2的水平低于WT水平或者与WT水平相当。

为了进一步研究rtS78T/sC69*和preS1/preS2del突变对病毒粒子释放的潜在影响，当S蛋白缺陷或缺失时，研究者利用小鼠单克隆preS1和核心抗体对上清分离的外泌体以及免疫沉淀病毒颗粒进行HBV-DNA分析。

结果显示：所有转染的样本（MI,M2,M3,WT）中均检测到外泌体介导的HBV-DNA分泌。但S 区有提前终止密码子转染样本（M1）并没有降低与抗pres1分离颗粒相关的HBV-DNA分泌水平。然而，preS1/preS2del有缺失的样本（M2，M3），与野生型HBV相比，释放的HBV- DNA显著减少。

为了评估这些突变是否对细胞内S和核心蛋白表达水平有影响，研究者在转染6天后采集细胞，利用相关抗体复合物对样本进行流式细胞术分析。 通过体外转染实验和上述研究，该部分研究认为是rtS78T/sC69*突变而不是preS1/S2缺失显著增强了病毒复制能力。

突变体对抗病毒药物的敏感性研究

研究人员检测了细胞内HBV-DNA和HBV子代DNA水平(表明活跃复制)，以评估各自突变对病毒复制的影响。

所有三个突变体(M1-M3)复制能力显著提高了，与野性型相比在肝癌细胞中瞬时转染6天后其子代DNA水平比野生型病毒提高了1.5倍。细胞外HBV-DNA与细胞内子代DNA趋势相同，这表明尽管HBsAg被截断，病毒粒子的分泌并未因这些突变而受损。

研究人员同时体外评估了三种突变体对ETV和TDF敏感性水平，评估方法通过检测细胞内HBV DNA水平和子代HBV DNA水平（表示活跃复制）以及细胞外HBV DNA水平，结果显示ETV(1μM)或TDF(20μM)药物暴露导致野生型的细胞内HBV DNA水平减少超过50%，而M1, M3(包含rtS78T突变)却有更高的复制水平，细胞外的HBV DNA水平检测结果显示与细胞内结果相同，同时也再次表明尽管S蛋白被大量截短，HBV-DNA的分泌并没有受损。

突变体耐药水平的更详细分析显示，M1和M3突变体中，与rtS78T/sC69*相关的ETV和TDF治疗的半最大有效浓度(EC50)是野生型HBV的1.57和1.63倍，这表明抗病毒药物敏感性下降。

该部分研究认为，rtS78T/sC69*（M1和M3）导致了病毒对药物的敏感性降低，pre1 /S2缺失(M2)与ETV和TDF抗病毒治疗敏感性的改变无关。

③主要文章结论

在本研究中，描述了两个慢性HBV感染患者在长期抗病毒治疗期间rtS78T/sC69*突变的发展。在患者A中，这一突变可能是在TDF单药治疗期间发生的，病毒株在TDF/ETV联合治疗期间进一步被选择，并与侵袭性和最终致死的HCC相关。患者B在ETV/TDF联合治疗中出现这种突变，并伴有preS1/S2区261bp核苷酸缺失。

研究人员从的体外分析表明rtS78T/sC69*的增强了病毒复制效率，并且该突变对ETV和TDF有部分耐药性，该突变可能有利于这些分离株的长期存活。文中提到有先前研究报道NAs治疗期间S蛋白的HBV病毒株截断S蛋白的HBV病毒株受到选择，并且其与HCC的发展有关。同时有文献报道，rtS78T突变与其他位置突变导致对ETV的敏感性降低2倍。

另外，基于计算分析rtS78T的突变病毒对于TDF的亲和力大大下降。另外一种可能性，rtS78T接近D83，该碱基与YMDD一起形成逆转录的催化中心。

研究人员还发现sC69 *突变导致HBsAg缺失，导致HBsAg检测出现异常，产生免疫反应逃逸。在抗病毒治疗期间，该突变出现导致的免疫反应逃逸并长期存在是发生某种特定风险迹象，以及随后的并发症包括发展成为肝细胞癌。

④篇后语

本篇文章为德国报道了ETV和TDF联合治疗的出现2例表型耐药的案例，通过测序方法检测出了2例患者HBV病毒共同rtS78T/sC69*突变，同时通过体外实验证明了rtS78T突变与病毒的复制能力增强和对于ETV和TDF药物敏感度下降有关，发表权威的国外杂志（Journal ofHepatology ,IF 15.04, 2018年）。

目前虽然ETV的耐药机制基本比较清晰，也陆续有新的耐药位点报道；而对于TDF的耐药机制有待进一步研究，除了本篇文章报道TDF药物敏感性相关的突变位点，其他研究通过体外实验也有报道TDF敏感性下降的相关突变位点，如A194T、A181V、N236T位点，近2年也陆续也有TDF耐药案例相关文章最新报道，包括韩国和国内的报道，随着TDF在临床进一步应用，相信会有更多耐药案例出现，耐药机制也会更加清晰。

这些报道提示临床医生和患者，在核苷类似物长期治疗均期间，包括使用一线的核苷（酸）类似物具有发生耐药或药物不敏感的可能性，包括TDF，不能忽视。这与核苷（酸）类似物的作用机制有关，长期治疗病毒会发生免疫逃逸，产生耐药相关突变，并会导致疾病进一步进展。

临床治疗过程中，一旦发现类似的案例，需加以关注，需要及时进行HBV P区的DNA测序，这将有助于医生了解患者体内的病毒变异情况并制定合理的治疗方案。如果有条件可以进行进一步体外实验研究，对进一步研究核苷（酸）类似物的药物的不敏感或耐药机制具有重要意义。

本文主要作者来自德国RWTH-Aachen大学医学院和美国普林斯顿大学分子生物系等机构