再次进化！刘如谦团队升级线粒体碱基编辑器，效率更高，范围更广

撰文 | 王聪

编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

线粒体（mitochondrion），是细胞的“能量工厂”，线粒体内有一套独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），人类mtDNA的长度为16569bp，拥有37个基因，编码13种蛋白，这些蛋白都参与细胞的能量代谢。

由于线粒体在能量稳态中的重要作用，mtDNA中的单碱基突变就可导致发育障碍、神经肌肉疾病、癌症进展等等多种人类疾病。因此，开发针对mtDNA的基因编辑工具一直是线粒体遗传学领域的长期目标。 在mtDNA中精确诱导碱基突变，有助于解释这些突变在发病机制中的作用，也可作为相应的治疗方法。

第一代基因编辑技术ZFN和第二代基因编技术TALEN，可以靶向含有特定基因突变的mtDNA，从而消除突变的mtDNA。但这两种方法都只能消除mtDNA，而不能引入特定的序列变化。

第三代基因编辑技术CRISPR，包括Cas9、Base Editor、Prime Editor，需要gRNA引导Cas蛋白与目标DNA结合，但目前并无有效方法将外源RNA高效导入线粒体内，这导致基于CRISPR的基因编辑工具无法应用于线粒体基因编辑。

2022年4月4日， 刘如谦 团队在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为： CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA 的研究论文。

刘如谦团队对其两年前开发的线粒体碱基编辑器DdCBE进行了重要升级，通过噬菌体辅助连续进化 （PACE） 和噬菌体辅助非连续进化 （PANCE） 技术对DdCBE进行定向改造，开发出了两个升级版DdCBE， 这两个升级版DdCBE不仅具有更高的编辑效率，还具有更广泛的序列编辑范围，除了编辑线粒体基因，还能编辑细胞核DNA。

这项研究为在人类线粒体中进行高效基因编辑提供了新工具，也大大提高了对全蛋白碱基编辑的有效性和适用性。

2020年7月8日，刘如谦团队在 Nature 杂志发表了题为： A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing 的研究论文。

研究团队发现并命名了一种细菌毒素——DddA，它可以催化双链DNA （dsDNA） 中胞苷的脱氨，将胞嘧啶 （C） 转化为尿嘧啶 （U） 。 将DddA分裂半体与转录激活子样效应子阵列蛋白 （TALE） 和尿嘧啶糖基化酶抑制剂融合，产生无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器——DdCBE，可催化人mtDNA中C•G到T•A的转化。

这一 不依赖CRISPR的碱基编辑器——DdCBE ，能够实现对线粒体基因组 （mtDNA） 的精准编辑，为研究线粒体遗传病和治疗线粒体遗传病带来了前所未有的工具。该研究也被认为是“问鼎线粒体研究领域的圣杯”。

这项突破还要从2018年说起，当时华盛顿大学的 Joseph Mougous 教授实验室的博士后 Marco de Moraes 在实验中无意间发现了一种细菌毒素——胞苷脱氨酶DddA，DddA可以在DNA双链上催化胞嘧啶 （C） 转化为尿嘧啶 （U） ，这是前所未见的。

Joseph Mougous 教授决定与开发了单碱基编辑技术的刘如谦团队合作，合作之初，两个团队便意识到DddA与碱基编辑器 （Base Editor） 相比并无明显优势。这促使研究团队改变研究方向，随后，麻省总医院研究线粒体功能障碍专家 Vamsi Mootha 加入研究团队。

为了将细菌毒素DddA应用到线粒体基因编辑中，还需要克服三大难题：

首先 ，DddA属于胞苷脱氨酶，它对哺乳动物细胞有毒，无法直接使用。为此，研究团队将DddA蛋白拆分为无活性的两半，称为split-DddAtox halves。 然后，将这一半的DddA与TALE蛋白融合。人工设计的TALE蛋白可与特定的DNA分子结合。当两个TALE与mtDNA结合后，原本被拆成两半的DddA重新聚集在一起，恢复了催化碱基编辑的活性。

其次 ，想要将这一基因编辑工具递送到线粒体基质中，它们必须要穿过线粒体的双层膜。因此，研究团队使用线粒体靶向信号的氨基酸序列标记了构建的基因编辑工具。对于线粒体双层膜来说，这一基于蛋白的导入机制比基于RNA的导入系统（如CRISPR-Cas9）更具优势。

第三 ，DddA是将胞嘧啶 （C） 转化为尿嘧啶 （U） ，U是RNA特有的碱基，虽然U跟DNA中的胸腺嘧啶 （T） 相对应，具有相同的碱基配对特性，但它毕竟属于RNA，当U出现在DNA上，很容易在尿嘧啶-DNA糖基化酶作用下从DNA上切下。 因此，研究团队将TALE–DddA分裂半体与尿嘧啶糖基化酶抑制剂 （UGI） 融合。这样可以保护U免受糖基化酶的干扰，直到下一轮DNA复制或修复发生为止，此时互补链的鸟嘌呤 （G）（在编辑前与C配对） 被腺嘌呤 （A） 取代， UGI的加入使编辑效率提高了大约八倍。

最终，研究团队构建了由线粒体靶向信号肽、TALE蛋白、DddA分裂半体及尿嘧啶糖基化酶抑制剂 （UGI） 组成的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器——DdCBE。该编辑工具可以有效导入人细胞中的线粒体，并精准编辑线粒体基因（mtDNA），催化人mtDNA中C•G到T•A的转化的编辑效率在5%—50%之间。

对于初始版本的DdCBE而言，DddA有严格的序列偏好，导致DdCBE 主要限于对T C 位点的编辑， 在这项最新研究中，刘如谦团队通过 噬菌体辅助连续进化 （PACE） 和 噬菌体辅助非连续进化 （PANCE） 技术对DdCBE的胞苷脱氨酶DddA进行定向改造，开发出了一系列突变体DddA。

与初始版本的DdCBE相比，具有定向进化而来的 DddA6 和DddA11的DdCBE对TC位点的mtDNA碱基编辑效率平均提高了约4.3倍。具有DddA11的DdCBE则具有更广泛的序列兼容性，能对TC、A C 、C C 位点进行更高效的编辑。此外，将线粒体靶向信号肽替换为细胞核信号定位肽后，它们还能对细胞核DNA进行高效且精准碱基编辑。

研究团队进一步分析了这两个升级版碱基编辑器的脱靶效应，结果表明，相比初始版本，它们在某些位点的脱靶性略有升高，但脱靶：上靶的比值与初始版本相似。

总的来说，该研究通过噬菌体定向进化技术，开发出了升级版线粒体碱基编辑器，具有更高的编辑效率个更广泛的编辑范围，能够在线粒体基因组和细胞核基因组的TC和非T C 位点实现更高效率的精准碱基编辑，大大提高了全蛋白碱基编辑的有效性和适用性。

线粒体作为细胞的“能量工厂”，线粒体基因组 （mtDNA） 与人类的衰老、癌症，以及其他多种疾病有着密切关系，线粒体碱基编辑器DdCBE的发明和改进，也为相关研究和疾病治疗带来了全新工具。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01256-8

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4