通过先进的成像方式对肾脏矿化和结石形成的新见解

通过先进的成像方式对肾脏矿化和结石形成的新见解

目的/目标：

最常见的肾结石由草酸钙组成，形成于称为兰德尔斑块的间质磷酸钙矿物上。由于有关导致纳米尺寸的间质磷酸钙预簇初始沉积的事件的信息有限，因此关于磷酸钙沉积的初始位点和导致结石形成的因素仍然存在争议。

材料和方法：

使用高分辨率micro-CT，光学和电子显微镜技术来表征人肾锥体和具有可识别茎的五种代表性肾结石。这些标本中矿化聚集体的矿物密度与使用光和电子显微镜技术看到的微观和超结构相关。

结果：

在人肾中最早检测到的生物矿物质是近端管内板状磷酸钙沉积物。通过电子显微镜和micro-CT观察与磷酸钙结石相连的茎中的未闭合小管。这些小管的直径（ 30 - 100μm）和形状与在肾远端区域观察到的肾小管相似。

结论：

观察结果是通过一种新颖而统一的逐步结构引导生物矿化理论（较小结构的组合导致更大但相似的结构框架）进行模式化的。提出了肾脏生物矿化的合理逐步进展;近端管内磷酸钙沉积物可导致间质但富含磷酸钙的Randall斑块，并成熟为一根茎，草酸钙结石在肾脏的收集系统中生长。 1. 引言 肾结石或肾结石是一种常见疾病，影响美国约1/11的个体，并且随着糖尿病和肥胖的增加而变得更加普遍[ 1 ]。百分之七十的结石和结石主要是草酸钙晶体[ 2 ]。结石通常在肾脏收集系统内形成，并附着在称为兰德尔斑块（ RP ）的肾的磷酸钙病变上。或者，结石有时可能作为Bellini导管塞的一部分形成（由于高草酸尿和远端肾小管性酸中毒，常见于接受过胃旁路术的患者）或游离溶液（例如胱血尿）[ 3 ]。目前的研究将集中在草酸钙成核到RP上的经典机制。肾脏的矿化病变（如RP）属于一类称为肾钙质沉着症的类别，与肾盂和输尿管内的结石相反，肾盂和输尿管内的结石被归类为肾结石。 1937年，亚历山大·兰德尔（Alexander Randall）首次在17%的检查尸体肾脏中描述了RP[ 4 ]。后来， Anderson 及其同事在整个中发现了微观钙化，并认为这些甚至可能代表正常的生理过程 [  5  ] 。随后，Carr通过放射学检测了这些钙化，并提出了其沉积和传播的淋巴机制[ 6 ]。Anderson ， Carr 和 Randall 的理论被 Bruwer 合成为一种称为 Anderson - Carr - Randall 进展的逐步教条，其中这些微观钙化将通过淋巴液流从近端迁移到远端间质成为 RP [  7  ] 。然而，将近端观察到的耻管内矿化与远端间质性 RP 联系起来以支持 Anderson-Carr-Randall 进展的致病证据尚未确定。 在过去的几十年里，已经进行了多次尝试来描述RP形成和随后的石头生长的煽动性事件。许多研究和兴趣都集中在发现斑块的间质区域，而具有更高分辨能力的新型成像方式已经开始揭示以前未描述的上游矿物[ 8-11 ]。尚未显示肾内近端肾小管中矿物质形成与肾脏收集系统中最终大规模结石之间的致病关系。在这项研究中，提出了一种关于RP发展和进展为完全形成的茎，然后形成肾结石的新理论，以及对潜在特定部位靶向药理学干预的见解。结果将说明人肾内（通常为金字塔形）内特定部位凝结物的半定量图谱，以提供对特定部位生物矿物质的结构和矿物质密度变化的见解。此外，还讨论了将近端生物矿物质与通常观察到的远端间质性RP，茎以及随后的结石联系起来的理论。 2. 材料和方法

2.1. 标本制备

加州大学旧金山分校人类研究保护计划委员会，IRB # 14-14533，授权在常规临床护理过程中肾切除术时收集人肾锥体。在肾切除术时切除 30 多个人并固定在福尔马林中。如果潜在病理学没有扭曲外科医生确定的肾锥体的正常粗大结构，则纳入标本。由于正常解剖结构的扭曲，排除了具有慢性结石形成、慢性感染、肾盂积水/梗阻和/或囊性肾脏疾病病史的肾脏肾锥体。将肾锥体置于福尔马林中，并使用立体显微镜检查所有标本的RP阳性或阴性，通过在肾锥体远端三分之一的地下层存在可见斑块而将其分类为RP阳性或阴性。 根据相同的IRB方案从接受经皮肾镜取石术或输尿管镜检查的患者中获得结石。在500多块宝石的目录中，选择了代表带茎宝石种群的五个标本进行详细分析。结石在视觉上似乎没有碎片，并且先前通过完整且可识别的茎附着在肾上。在成像前使用0.31 Mrad伽马辐射对标本进行灭菌[ 12 ]。

显微CT、矿物密度评价

在潮湿条件下使用高分辨率X射线微计算机断层扫描（Micro XCT-200，Carl Zeiss Microscopy，Pleasanton，CA）单元以4倍放大率扫描肾脏的肾锥体。在潮湿条件下，还使用相同的micro-CT扫描仪以4X和10X放大倍率扫描石标本，该扫描仪具有#2源滤光片，40 kVp，光束硬化常数为2。根据micro-CT扫描仪的参考校准方案确定矿物密度[ 13 ]。对五个试样进行了矿物密度的平均分布（对于低密度和高密度区域），并与高斯曲线分割的那些与五个试样的平均矿物密度剖面拟合进行比较。在结石标本中鉴定小管，并使用定制的MATLAB（R2013b，MathWorks Inc.，Natick，MA）代码来分析小管直径。生成高斯分布以最符合管径分布，并以高斯曲线的峰值作为代表管径。当峰值之间的绝对差值至少为峰的半最大值的两个半宽之和时，小管被认为具有不同的结构/直径[ 14 ]。

2.3.扫描和透射电子显微镜技术

在显微 CT 之后，将所有标本嵌入 LR-白色树脂（Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA）中，用慢速锯沿中线切割，然后进行金刚石抛光。1 kV 场发射扫描电子显微镜 (SEM) (SIGMA VP500, Carl Zeiss Microscopy, Pleasanton, CA) 和光学显微镜 (BX51, Olympus Scientific Solutions Americas Corp. Waltham, MA) 技术在抛光表面上以不同的放大倍率进行，以使多个长度尺度的结构评估。对乳头的近端区域进行透射电子显微镜检查。

去：

3. 结果

肾锥体标本的代表性显微 CT 扫描始终显示肾锥体近端和远端位置的矿化区域。近端和远端矿化区呈正相关；在所有病例中都发现了近端矿物质，而仅在具有广泛近端矿化的标本中发现了远端矿物质。近端矿物使用 SEM 定位，并且位于管腔内（图 1），其中包含完整的管状细胞和细胞核 (*)，如图 1a-c 所示。随后，当使用SEM（图2).在图 2a 中，可以看到矿化的小管向淌到肾远端部分的矿化间质（ 2b 中的细节）。管状管腔似乎专利，尽管周围组织钙化（图 2b、箭头和括号）。在2c中进一步发现间质矿化，其中可以观察到与附近矿化肾小管壁相邻的血管内红细胞（*）。还鉴定了间质胶原原纤维（而不是疶内）中的原纤维内矿物质（图 2d).回顾了微CT和电子显微镜数据与提取管内和间质矿物质的上下文信息之间的相关性，图 3.

图 1.  近端区域的管内矿物质： 矿物位于管状腔内。偶尔，在（a）中也可以看到具有细胞核（*）的完整肾小管细胞，并且细节越来越多，如（b）和（c）所示。具有代表性的管内矿物质与邻近的红细胞（箭头）如（d）所示。

图 2. 检查远端： 通过使用电子显微镜对超切远端的表面进行成像来观察解剖学上特异性的矿物质。在（ a ）中可以看到矿化的小管沿着的整个长度远端流淌，附近的矿化间质详细显示（ b ）。管状管腔是专利的（b，箭头），尽管它们的周围组织被矿化（b，支架）。在（c）中鉴定出进一步的间质矿物质，其中在相邻的矿化肾小管壁中观察到血管内红细胞（*）。还鉴定出一种矿化的胶原原纤维，表明间质（而不是耻管内）矿化（d）。

图 3. 来自X射线微型计算机断层扫描（micro-XCT）和扫描透射电子显微镜（STEM）技术的数据集的相关性： 人类肾的代表性 3D 体积如（ a ）所示。近端矿物经常被观察到在受影响的区域表现出板状沉积模式（箭头表示板）（b），并且在更近端的位置（c）一致地被鉴定为管内（箭头表示肾小管细胞核）。在远端，矿化的管状腔含有球形结构（d，e中的细节）。观察到这些颗粒在远端小管周围的组织中凝集，同时使这些小管专利（f）。球形颗粒（用箭头表示）和凝聚斑块（用箭头表示）也在血管周围间质（g&h）中被识别出来。P：近端;D：远端 代表性的显微 CT 图像显示在 图 3a .经常观察到近端位置的矿物质在受影响区域表现出板状沉积模式（ 图 3b ).这些矿物质在更近端的位置（ 图3c ).在远端，鉴定出矿化的管状管腔并含有球形矿物结节，这一观察结果与先前报道的钙化纳米颗粒（CNPs， 图 3d-e ) [15，16]。观察到这些颗粒在远端肾小管周围的组织中凝集，同时使这些肾小管腔通畅（ 图 3f ).在血管周围间质（ 图 3g-h ). 仔细检查了附着在可识别的完整茎上的五种代表性结石，因为它们形成于称为RP（ 图 4 ).对五块茎秆完整的结石进行 X 射线显微 CT 的数据进行体积渲染，每块有茎的结石显示在 图 4a ，而虚拟截面 （ 图 4b ）揭示了结石（较暗区域）与其茎（较亮区域）相比的不同 X 射线衰减。结石的平均矿物密度为711毫克/毫升，茎为1，182毫克/毫升。使用SEM以更高分辨率的茎石界面的微结构显示在 图 4c .宝石的下放大倍率电子显微照片显示在 图 4c .有趣的是，在标本3-5（ 图 4d ），在结石的茎内鉴定出直径高达20μm的完整和专利小管，而使用micro-CT在所有标本中都观察到平均直径为65μm的较大管状管。

图 4. 检查茎石界面： 图中显示了五种具有可识别茎的代表性宝石。带有茎的石头的3D体积渲染图像显示在（a）中，而横截面图像（b）显示，与基于Hounsfield单位的高密度茎（较亮区域）相比，石头的矿物密度较低（较暗的区域）。使用扫描电子显微镜观察到的相同宝石的物理横截面可以在（c）中看到，而在更高的放大倍率下，同一横截面中包含的石茎界面的细节显示在（d）中。根据切片平面的不同，在结石的茎内发现了完整且看似未见的肾小管（3-5 in d）。 转到(G)：

4. 讨论

从根本上说，形式和功能是相互联系的。所有哺乳动物肾脏血液过滤的功能单位是肾单位;它是一个直径从 30 - 150μm不等的几厘米长的小管，通过肾脏区域编织蛇形路径，该区域被分割为皮质，延髓和（后两个区域是肾锥体内的主要功能区） [  17  ] 。以下讨论将涉及肾上腺皮锥体肾内发生的生理过程[ 18 ]。许多主动和被动的离子交换过程发生在肾单位内，本讨论将集中在肾锥体的解剖学特定区域中观察到的矿物质，包括通常在尖端的间质基质中观察到的矿物质，以及该区域内的肾小管。 肾小球是肾单位过滤的部位，就像一个生物筛子，将蛋白质和血细胞从将成为尿液的液体中分离出来。血液首先从传入小动脉通过，然后通过肾小球过滤到鲍曼的囊中。剩余的血液进入传出小动脉进入体循环。现在的尿液通过各种肾单位段，这些肾单位段从外皮层进入内髓质并反复返回。该过程利用离子的主动和被动传输以及影响不同细胞类型及其功能的陡峭浓度和压力梯度。这些不同的区域使溶质集中;尿液中的基本排泄产物。尿液首先通过近端波纹小管，通过进入Henle环下降、薄和上升四肢内的延髓而离开皮质，其中间质中陡峭的浓度梯度有利于溶质的逆流交换[ 19 ]。最终，液体进入远端曲折的小管，然后作为尿液进入收集管和肾盂。 尿液最初含有大量的溶质，这些溶质在离开肾单位作为尿液之前被高度输送回血液。如上所述，大分子最初在肾小球水平上过滤，留下富含葡萄糖，钠，氯化物，钾和其他离子的溶液。在近端曲折的小管中，约 60% 的钠、钾和钙与 80% 的磷酸盐、水和碳酸氢盐以及几乎 100% 的葡萄糖一起被再吸收。接下来，当液体通过厚而薄的片段沿着 Henle 的下降肢环进入时，会产生陡峭的间隙浓度梯度，高达 1400mOsm / kg 。间隙远端渗透压梯度的主要驱动因素是尿素 [  18  ] 。多年来， Henle 在状远端区域的环的薄肢被认为是称为 RP 的磷酸钙凝结的起源地 [  8  ] 。体外研究计算出，在Henle的环路内，管内液体达到磷酸钙的过饱和浓度[ 20 ]。 溶质从小管中输送出来并进入间质，因为与间质相比，尿积变得越来越低渗。在间质尖端达到最高的溶质浓度，正是在观察到 RP 的地方。在脱水状态下，不透水的收集管将通过水通道蛋白的表面表达转变为可渗透状态，允许水的再摄取，这种陡峭的浓度梯度促进了水的再摄取，并维持了全身液体稳态。通过离子交换在间质中保持电荷中性。然而，目前尚不清楚为什么当尿素是浓度梯度的主要驱动因素时，磷酸盐沉积在该区域受到青睐。 鉴于如此陡峭的浓度梯度，生理压力以及西方饮食对肾脏的沉重负担，这种过滤系统的矿化可以完全避免是一个奇迹。对于这种稳态机制以某种方式征税的个体中，可以想象随着时间的推移，生物矿物质会形成。对RP起源的研究已经确定了小的钙沉积物，本文称为整个肾金字塔中的钙化纳米颗粒（CNPs）。Anderson和Carr在1940年代和1950年代首次注意到这些颗粒，其中在大多数标本中观察到小的矿物"液滴"[5，6]。后来，Cooke在Henle薄环的基底膜内发现了类似的矿化作用，延伸到62个正常肾脏中的43个的间质中[21]。Haggitt在1971年也发现了类似的发现，他使用了透射电子显微镜[15]。Evan 及其同事后来根据尖端的组织切片断言， Henle 薄环基底膜内的羟基磷灰石沉积物（由 CNP 组成）是肾脏钙化的初始部位 [ 8 ] 。此后的几年中，关于肾结石起源的研究主要依赖于对从肾尖端活检的小组织碎片的分析 [ 9 ， 22 ] 。近八十年后，高分辨率X射线断层扫描和使用光和电子成像方式的相关显微镜已经揭示并证实了安德森和卡尔观察到的近端钙化，此外还详细介绍了矿物的微观和超结构（ 图1 – 3 ) [5–7，11]。与近端相反，矿物质的结构通常是板状的，在远端间质（ 图 2d-f ). 尽管存在明显的解剖学特异性矿藏，但耻管内和间质矿物形成与茎和茎之间是否存在生物学联系，然后是结石形成，或者这些事件是否没有联系？根据先前的结果，我们认为由人类肾金字塔结构产生的流动力学可以帮助解释解剖学特异性矿物的形成[11]。将划分为 1 - 3 区，从近端第三区到远端第三区，可以表征小管直径和血管 - 直肠的分布（允许逆流交换的毛细血管网络）。据推测，压差对组织生物力学的影响可以基于泊塞伊定律（等式1）来描述。  

P∝8 μπr4 ，其中压力 （P） 与流体的动态粘度 （μ）、小管的长度 （L） 和体积流量 （Q） 成正比，并且与小管半径 （r） 的四次方成反比。在Henle环较窄的薄肢体中，当近端小管在小管壁附近收集生物矿物质时，压力"P"将显着增加"r"的微小变化（其中流速明显低于中心线速度）。从根本上说，外周小管（由于的抛物面形状而更短）将具有成比例的较低流体流动速度，并且更有可能聚集固体碎片。上述假设得到了以下观察结果的支持：所有标本中1区更近端和外围区域的微钙化（ 图 3a ）在没有远端间质性RP的情况下观察到。此外，随着近端矿化的增加，RP的含量成比例增加。鉴于近端矿物的普遍存在以及近端矿物量与RP量之间的明显直接相关性，我们认为近端矿物可能先于RP形成[11]。在本研究中，完整的肾小管细胞与近端位的板状矿物质相邻（Figs 1a-c , 3b-c ），支持这些钙化是管内钙化的假设。RP 似乎是一种间质沉积，因为远端内腔通畅，见于 图 2 以及 图 3d-h ，与先前的研究一致[8]。可以想象，增加近端矿化可能会刺激兰德尔的间质斑块。 随着被称为RP的磷酸钙凝结的稳步增长，它最终通过表下乳头状上皮爆发，并暴露于肾脏收集系统花萼中的浓缩尿液[ 4 ， 9 ， 23 ]。尿液浓缩在尿酸和草酸盐中，可促进晶体生长，最常被鉴定为钙和草酸盐。偶尔，如果给予足够异常的pH值，一定比例的尿酸或磷酸盐会沉淀[ 24 ]。由于RP沐浴在尿液中，以磷灰石为主的表面有利于草酸盐的形成，从而导致牙结石的稳定生长[ 9 ， 25 ]。

这种结石通常会从肾脱落，随后阻塞输尿管，引起明显的疼痛，在某些情况下会导致肾功能衰竭和 / 或感染。偶尔，在肾结石的手术治疗期间，也可以识别具有RP附着部分的结石，本文称为"茎"。 在这项研究中，获得了五个这样的标本，并使用micro-CT和扫描电子显微镜技术进行了表征。Micro-CT揭示了茎和结石之间矿物密度的差异，结石主要由于元素组成不同而表现出异质性[14]。这些茎的电子显微镜和微CT显示，在某些情况下，直径等于肾小管的专利腔，肾尖内Henle的薄环（ 图4 ;D3-D5）。我们认为这是断言这些词干确实由RP组成的支持证据。我们已经通过透射电子显微镜检查证明，RP似乎是一种间质过程，并且根据先前发表的数据，结石茎内完整小管的存在支持这一点[4，8，9]。 值得注意的是，本研究存在一些局限性。首先，肾锥体不是从结石形成个体获得的，因为在肾癌肾切除术时，在远离癌症的部位切除了，这些部位在解剖学上似乎是正常的。所检查的结石没有在所研究的特定上形成，并且根据茎样外观和磷酸钙区域的存在或由于外科医生在手术时将标本从中取出而推测在 RP 上形成。作为另一项研究（正在审查）的一部分，对斑块化学成分的能量色散X射线光谱数据进行了研究[ 26 ]。 

综上所述，近端管内钙化、远端间质钙化和茎均显示磷酸钙茎内两个专利肾小管的结石提示事件从肾钙质沉着症逐渐进展为肾结石（ 图 5 ).当近端肾小管被板状钙组成碎片阻塞时，由此导致的流体动力学变化和液体流量转移将诱发远端间质生理的变化。CNPs将通过尚未表征的机制稳步积累，导致磷灰石的沉积物不断增加。当这些钙化通过上皮的地下层侵蚀到肾脏收集系统时，它使内窥镜可见，临床上称为兰德尔斑块。尿液继续通过钙化间质的专利小管滴流，并促进结石和"茎"之间的草酸钙界面的成核和生长，"茎"是RP的一部分。

图 5. 从近端到兰德尔斑块和茎上的结石的矿物进展模型： 

左侧显示了人类肾的示意图。在的顶部可以看到管内矿物质。当离子聚结形成预簇和钙化纳米颗粒（CNPs）时，它们随后聚集成更高阶的磷酸钙相，如无定形磷酸钙（阶段1-3加向右进展）。无定形磷酸钙最终会形成完全发育的兰德尔斑块（左下角和中）。兰德尔斑块（第 3 阶段）通过尖端的地下层侵蚀形成茎，并作为尿腔中结石生长的核化剂（左下角）。注：未按比例绘制原理图。 先前的研究发现，间质性 CNP 是肾中钙沉积的初始部位 [ 8 ] 。

相反，Anderson-Carr-Randall进展（由Bruwer于1979年提出）将近端钙化视为RP的前体，通过液体运输到肾尖远端间质区域形成[7]。

根据本研究的结果，该理论与腹状远端的球形结节相比，在近端肾锥体中观察到板状矿物质， 无花果 3b， 3e ).鉴于此，并且近端矿物质始终存在于存在或不存在远端矿物质的情况下，我们认为远端矿化是近端肾小管闭塞的下游过程，导致抛物面人肾金字塔中流体动力学的变化。在复杂的系统中，例如包含各种细胞，离子，小管和基质分子的肾锥体，钙化的纳米颗粒也可能是由内吞作用和管状细胞的间质沉积引起的。鉴于如此复杂的系统，有许多原因促使肾脏结构特异性生物矿物质，要问的问题是：是否应该通过解剖学特异性靶向方法指导药物干预？鉴定肾锥体近端的矿化事件作为远端矿化的时间前兆，最终可导致症状性结石事件，有助于未来靶向药物干预的发展。通过了解生物矿化（管内->间质->斑块->茎->结石）的逐步进展，我们将能够在不溶性和痛苦的草酸钙或磷酸钙显性结石发展之前进行干预。