6分+的m6A修饰+ceRNA分析，用在线工具就能完成！

导语

GUIDE ╲

葡萄糖转运体1(GLUT1)由SLC2A1基因编码，是对葡萄糖亲和力最大的葡萄糖转运体之一，GLUT1的异常表达与多种癌症有关。

背景介绍 

今天小编给大家介绍的这篇文章，作者已经确定了目标基因GLUT1，利用了常见的STRING、TIMER、CIBERSORT等常用的工具进行功能富集、网络分析以及  免疫浸润分析，还利用了TCGA数据分析GLUT1表达和m6A修饰的关系，构建ceRNA网络，确定了GLUT1可作为ESCA诊断和治疗的生物标志物。文章题目为：Comprehensive Analysisof GLUT1 Immune Infifiltratesand ceRNA Network in HumanEsophageal Carcinoma。

数据介绍 TCGA：39种肿瘤的10000+个样本数据；ESCA RNA-seq数据，162个肿瘤样本+11个正常样本。 GEO：ESCA RNA-seq数据（GSE23400，n=106;GSE38129, n=60）。  

结果解析 

01   GLUT1 mRNA表达的分析   

为了确定GLUT1在肿瘤和正常组织中的表达差异，使用Oncomine数据库分析肿瘤和正常组织中GLUT1mRNA的水平(图1A)。为了进一步评估GLUT1在人类癌症中的表达，使用TIMER数据库进行分析。GLUT1在不同肿瘤和邻近正常组织中的差异表达见图1B。

图1 

为了进一步评估GLUT1在ESCA中的表达，使用TCGA RNA-seq数据和GEO数据集进行分析，发现肿瘤组织中GLUT1 mRNA水平显著升高(图1C)。在未配对或配对的数据集中，肿瘤组中GLUT1 mRNA的表达明显高于正常组织(图1D，E)。为了验证数据分析的准确性，作者还使用qRT-PCR和IHC检测了ESCA细胞中GLUT1 mRNA和蛋白的表达。qRT-PCR结果显示，ESCA ECA109和KYSE-150细胞系中GLUT1 mRNA的表达显著高于人正常食管上皮细胞Het-1A细胞系(图1F)。IHC结果显示，肿瘤组织中GLUT1蛋白水平明显高于癌旁正常组织(图1G、H)。这些结果表明，GLUT1对ESCA的进展有潜在的致癌作用。 

02   ESCA中GLUT1基因共表达网络的富集分析和PPI分析   

为了进一步了解GLUT1在ESCA中的生物学意义，使用LinkedOmics数据库分析了GLUT1在ESCA中的共表达。如图2A所示，有4300个基因与GLUT1呈正相关，有6056个基因与GLUT1呈显著负相关(FDR<0.05)。热图显示了与GLUT1分别呈正相关(图2B)和负相关(图2C)的前50个显著基因。 

GO功能富集显示，GLUT1共表达主要参与细胞骨架的结构成分、中间丝结合、细胞-细胞粘附连接、表皮发育(图2D)。KEGG通路分析显示，GLUT1共表达主要与P53信号通路相关(图2E)。为了进一步了解GLUT1的潜在机制，使用STRING数据库研究了GLUT1的PPI网络(图2F)。

图2 

03   GLUT1的表达与ESCA中的免疫信号相关   

作者使用TIMER来分析GLUT1的表达是否与ESCA中的免疫浸润水平有关。如图3A所示，GLUT1的表达与B细胞(P=8.65×10-6)、CD4+T细胞(P=5.02×10-3)、巨噬细胞(P=2.53×10-3)和树突状细胞(P=3.81×10-2)的水平呈负相关。这些结果表明，GLUT1在ESCA的免疫浸润中起着关键作用。此外，还发现GLUT1 CNV与CD4+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平显著相关(图3B)。作者根据GLUT1的表达情况将162例肿瘤样本分为两组，其中高表达组81例，低表达组81例。分析22个免疫细胞在不同GLUT1表达组之间的表达差异，以确定ESCA中GLUT1高表达水平和低GLUT1表达水平之间的肿瘤免疫微环境是否存在差异(图3C)。

图3 

04   GLUT1的表达与ESCA中m6A调控因子相关   

m6A修饰在ESCA的发生发展中起重要作用。 作者分析了 TCGA ESCA 数据集以研究 ESCA 中 GLUT1 和 20 个 m6A 相关基因的表达之间的相关性（图 4A）。结果表明，ESCA中GLUT1的表达与7个m6A相关基因显著正相关。绘制一个散点图，显示GLUT1和m6A相关基因之间的相关性(图4B)。根据GLUT1的表达情况将162例肿瘤样本分为两组，其中高表达组81例，低表达组81例。分析不同GLUT1表达组之间20个m6A相关基因的表达差异，以确定ESCA中高GLUT1高表达水平和低GLUT1表达水平之间的m6A修饰是否存在差异(图4C)。结果显示，与低表达组相比，GLUT1高表达组中METTL3、VIRMA、YTHDC1、IGF2BP2、YTHDF2、HNRNPA2B1、HNRNPC、FTO、ALKBH5的表达量增加(P<0.05)。以上结果表明，GLUT1与ESCA中m6a的修饰密切相关。

图4   

05   ESCA中GLUT1相关ceRNA网络的构建  

 作者使用PITA、miRanda和TargetScan数据库分别分析和预测了79、28和18个GLUT1靶标miRNA。维恩图显示了在PITA、miRanDa和TargetScan软件中GLUT1靶标miRNA的预测结果。3个数据库共预测了14个靶miRNAs（图5A）。此 外还分析了靶标miRNA表达与GLUT1表达之间的相关性，以筛选出更符合ceRNA条件的miRNA。 如图5B所示，相关分析证明有3个靶miRNA表达水平与GLUT1呈负相关。 TargetScan 预测了 GLUT1 与目标 miRNA 的潜在结合位点（图5C）。

图5 

作者使用miRNet和starBase在线数据库进一步预测可能与三个靶miRNA结合的lncRNA，并通过维恩图展示它们(图6A-C)。作者使用starBase数据库分析了ESCA中靶标lncRNA表达与miRNA之间的相关性。如图6D所示，相关分析证实，有4个靶lncRNA表达水平与hsa-mi-miR-148b-3p呈负相关，分别为HOTAIRM1、LINC00174、OIP5-AS1和A1BG-AS1。然而，只有DHRS4-AS1的表达水平与hsa-miR-140-5p呈负相关(图6E)，而A1BG-AS1的表达与hsa-miR-148a-3p呈负相关(图6F)。 

基于ceRNA假设，miRNA与lncRNA或mRNA之间存在反比关系，可以构建6对ceRNA网络(A1BG-AS1-miR-148a-3p-GLUT1、HOTAIRM1-mIRM1-148b-3p-GLUT1、LINC00174-148b-1、-GLUT1-miR-1481-A1AS1-b-3p-GLUT1和DHRS4-AS1-miR-140-5p-GLUT1)的相关分析结果(图6G)。

图6     

小编总结 作者在这篇文章中使用了多种在线工具进行分析，并且加入了一些生物学实验验证结果，总的来说难度不高，但是思路比较清晰，是一套非常标准的单基因分析流程。       

END