科研 | FASEB Journal： 内源性昼夜节律系统和昼夜节律失调对人类口腔微生物群影响的原理论证

编译：微科盟R.A，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

       昼夜节律失调（Circadian misalignment）：中枢生物钟与行为和环境周期（包括睡眠/觉醒、禁食/进食、昼/夜节律）之间的失调，导致不利的心血管和代谢影响。这些不良反应的潜在潜在机制包括口腔胃肠道微生物群的改变。然而，人类口腔微生物群是否具有内源性昼夜节律（即：独立于睡眠/觉醒、禁食/进食和昼/夜周期）以及昼夜节律失调是否影响口腔微生物群落组成仍不清楚。共有6名健康的年轻志愿者[年龄介于18-35岁，年龄均值27.3±2.3，4名男性和2名女性，体重指数范围：18-28kg/m2]参加了严格控制的14天的昼夜节律实验室。这包括32小时恒固定节律实验（内源性昼夜节律基线评估）、强制不同步实验，在~3lx下有四个28小时“昼”以诱导昼夜节律失调，以及失调后40小时固定节律实验。在两种固定节律实验中，每4小时收集一次唾液样本，对微生物群进行评估。提取和处理总DNA并进行16S rRNA基因扩增子测序。特定口腔微生物群的相对丰度，即5个优势门中的1个和14个优势属中的3个，表现出显著的内源性昼夜节律。重要的是，昼夜节律失调显著改变了口腔微生物群，因此5个优势门中的4个和14个优势属中的8个表现出显著的昼夜节律失调效应。此外，昼夜节律失调显著影响口腔微生物群宏基因组（基于基因含量分析推断），这点可根据与代谢控制和免疫相关的特定功能途径的变化所示。总的来说，我们的概念验证研究为人类口腔微生物群中的内源性昼夜节律提供了证据，并表明即使是相对短期的实验性昼夜节律失调也会显著影响微生物群落组成以及参与代谢和免疫功能途径。我们这些针对原理验证的结果对于通常处于昼夜节律失调个体（包括：夜班工人和飞行常客）的口腔微生物的变化情况是具有解释意义。

论文ID

原名：Proof-of-principle demonstration of endogenous circadian system and circadian misalignment effects on human oral microbiota

译名：内源性昼夜节律系统和昼夜节律失调对人类口腔微生物群影响的原理论证

期刊：The FASEB Journal

IF：5.191

发表时间：2021.12.3

通讯作者：Sarah L. Chellappa; Frank A. J. L. Scheer;

通讯作者单位：美国布莱根妇女医院；美国哈佛医学院；

DOI号：10.1096/fj.202101153R

实验设计

实验设计图      

图1 研究设计。为期14天的实验室研究沿X轴显示相对时钟时间（例如，习惯性起床时间为上午7:00的参与者），沿Y轴显示研究日期。文章中提供的数据来自两个恒定的常规作息（constant routine），基本常规作息CR（CR1；第3-4天）和扰乱的CR（CR2，第11-13天）。在CR期间，参与者保持清醒，保持不变的姿势（半卧，上身呈45°角），持续昏暗的光线（光照水平<3lx），保持恒定的室温和湿度，并每小时接受等热量零食。在CR条件下，每4小时通过唾液采样并测序来评估口腔微生物群落组成。  

结果

1 口腔微生物群落组成表现出内源性昼夜节律

       在基本固定节律期间，我们在5个优势门之一的相对丰度和14个优势属中的3个中检测到显著的内源性昼夜节律。变形菌门的细菌表现出显著的昼夜节律（“昼夜节律效应”：F=5.1；p=0.03）。具有显著内源性昼夜节律的细菌属包括：梭杆菌属（变形杆菌门；“昼夜节律效应”：F=9.6；p=0.003）、梭杆菌属（梭杆菌门；“昼夜节律效应”：F=6.2；p=0.04）和链球菌属（厚壁菌门；“昼夜节律效应”：F=6.1；p=0.04）（图2A-D）。在失调后固定节律期间，在5个优势门之一和14个优势属中的两个的相对丰度中观察到显著的内源性昼夜节律。来自拟杆菌门的细菌具有显著的昼夜节律（“昼夜节律效应”：F=5.4；p=0.04）。具有显著内源性昼夜节律的细菌属包括二氧化碳噬纤维菌属（Capnocytophaga）（拟杆菌门；“昼夜节律效应”：F=3.6；p=0.03）和Neisseria属（变形杆菌门；“昼夜节律效应”：F=3.2；p=0.03）。用MetaCycle对细菌属的自回归谱估计回归分析显示，在固定节律期间，Neisseria属和二氧化碳嗜细胞菌属以及在失调后固定节律期间细菌属Gemellaceae、普雷沃氏菌和Lautropia属具有显著的内源性昼夜节律特性（如表S1所示)。值得注意的是，当使用Metacycle的自回归谱估计回归分析（数据未显示）时，α多样性指数没有显示显著的昼夜节律效应。

图2 人类口腔微生物群的内源性昼夜节律。昼夜节律的余弦分析(Cosinor analysis)应用于口腔微生物群落组成。变形菌门(A)和Neisseria属(B)具有显著的内源性昼夜节律（固定节律期间评估结果）。梭杆菌属(C)和链球菌属(D)也显示出显著的内源性昼夜节律（在固定节律期间评估）。余弦模型使用精确的昼夜节律相位数据。为了表明这些模型充分拟合了实际数据，我们还绘制了分组到60-昼夜节律度窗口（4-h分辨率）的平均数据。底部x轴对应于昼夜节律相位，0°表示拟合的昼夜节律核心体温最小值的时间。顶部x轴表示相应的平均时钟时间；左y轴对应于固定节律期间每个人的平均值的百分比；右y轴表示平均相对丰度（占总丰度的百分比）；p值：来自余弦分析(Cosinor analysis)的“昼夜节律效应”的显著性。

 图3 昼夜节律失调影响人类口腔微生物群。气泡图说明了昼夜节律失调对门(A)和属(B)分类水平的口腔微生物群组成的影响。数据对应于五个优势门（>1%的相对丰度阈值）和14个优势属（>1%的相对丰度阈值）。每个气泡图对应于从固定节律到失调后固定节律(固定节律2-固定节律1)的差异。X轴：数据(1)标准化为固定节律期间每个参与者平均值的100%，(2)去除趋势以去除线性分量，(3)对每个固定节律条件的所有时间点取平均值，(4)得出差异从固定节律到个体水平的失调后固定节律，以及(5)对所有参与者、每个门和属进行平均。Y轴：5个优势门(A)和14个优势属(B)，按流行率排序。每个气泡图的面积对应于两个固定节律实验步骤中所有参与者的平均每个给定门和属的流行率。数据对应于平均值和平均值的标准误差（SEM）；p值：“昼夜节律对齐条件”（对齐与未对齐）的显著性来自余弦分析(Cosinor analysis)（详见“统计分析”）。   

2 昼夜节律失调对口腔微生物群落相对丰度和内源性昼夜节律的影响

       我们发现：5个优势门中的4个和14个优势属中的8个表现出显著的昼夜节律失调效应（余弦分析Cosinor analysis中“昼夜节律对齐条件”的影响），表明昼夜节律失调对口腔微生物群的相对丰度的广泛影响。对于更普遍的门：厚壁菌门（流行率：48.1%；“昼夜节律排列条件”的影响：F=15.3；p=0.002）和变形杆菌（流行率：23.1%；“昼夜节律对齐条件”：F=5.9；p=0.017）。对于不太流行的门，拟杆菌门（流行率：14.7%；“昼夜节律排列条件”的影响：F=11.2；p=0.001）和梭杆菌（流行率：6.9%；“昼夜节律对齐条件”：F=4.9；p=0.03）。从固定节律到失调后固定节律，厚壁菌门的相对丰度降低了6.9±2.1%，而变形杆菌、拟杆菌和梭杆菌的相对丰度分别增加了8.3%±3.4%、16.8%±5.6%和16.5%±50%，（图3A）。对于流行率最高的属类群，即链球菌，也检测到显著的昼夜节律失调效应（厚壁菌门类群；流行率：27.8%；“昼夜节律对齐条件”的影响：F=4.0；p=0.04）。

       此外，还观察到变形杆菌门内的两个属的显著失调效应，即嗜血杆菌属（流行率：9.4%；“昼夜节律排列条件”的影响：F=5.0；p=0.03）和Neisseria属（流行率：6.9%；“昼夜节律排列条件”的影响：F=14.4；p=0.002）。在梭杆菌门内的一个属中检测到显著的失调效应，梭杆菌（患病率：4.8%；“昼夜节律对齐条件”的影响：F=14.8；p=0.002）。拟杆菌门内的四个属也发生了显著的失调效应。这些是Prevolla属（流行率：3.3%；“昼夜节律条件”的影响：F=13.6；p=0.004）、Porphyromonas属（流行率：2.8%；“昼夜节律条件”的影响：F=18.0；p<0.001），未分类的Gemellaceae属（流行率：2.3%；“昼夜节律条件”的影响：F=12.8；p=0.006）和二氧化碳噬纤维菌属（流行率：1.3%；“昼夜节律条件”的影响：F=50.4；p<0.001）。总的来说，我们观察到最流行的属链球菌的相对丰度从固定节律到失调后固定节律降低了-5.5±4.7%，而初始相对丰度<10%的分类群的相对丰度失调。嗜血杆菌(7.3%±5.2%)、Neisseria(8.2%±6.3%)、梭杆菌(22.6%±5.5%)、普雷沃氏菌(58.4%±5.1%)和Gemellaceae(62.1%±8)和Capnocytophaga属(42.9%±55.3%)丰度升高(图3B)。此外，使用相似度分析（ANOSIM）的进行β多样性分析，发现个体和群体水平上的唾液微生物群落存在显著的昼夜节律失调效应（p<0.05）（表S2）。确定每个个体固定节律中细菌属丰度的差异，然后通过高丰度或低丰度微生物的变化来评估昼夜节律失调的影响（表S3）。

       我们还评估了昼夜节律失调对口腔微生物群落组成的内源性昼夜节律的影响。我们并没有观察到“昼夜节律排列条件”和“昼夜节律效应”之间对口腔微生物群门和属的相对丰度的显著相互作用，尽管一些微生物群落门/属似乎在昼夜节律失调后表现出昼夜节律幅度降低并且似乎失去节律性（如图S1所示：变形杆菌门（A）和Neisseria属（B）、梭杆菌属（C）和链球菌属（D））。此外，我们评估了昼夜节律失调对口腔微生物群多样性（α多样性）的影响。当个体被分组时，我们观察到从固定节律1到固定节律2的α多样性指数没有显著变化。然而，我们确实发现：固定节律1到固定节律2的6个个体中有5个的α多样性指数（p<0.05）存在显著差异（表S4），从固定节律1到固定节律2的所有α多样性指标总体上都有所增加。

  3 昼夜节律失调影响与口腔微生物群落组成相关的功能通路

       最后，我们研究了昼夜节律失调对口腔微生物群宏基因组功能基因含量的影响。从固定节律到失调后固定节律（表1），15种功能通路的相对丰度发生了显著变化（p<0.05）。昼夜节律失调降低了五种功能途径的相对丰度：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；蛋白质出口；甘油脂代谢；复制、重组和修复蛋白质和硫胺素代谢。相反，昼夜节律失调增加了10种功能通路的相对丰度。这些包括硫代谢；参与超长链脂肪酸分解代谢的过氧化物酶体（过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs；由脂肪酸激活的核激素受体））；霍乱弧菌致病循环；硫辛酸代谢；万古霉素的生物合成；细胞抗原；与结构和信号分子相关的苯丙烷生物合成；减数分裂；和芪类、二芳基庚烷类和姜酚的生物合成（表1）。

表1 昼夜节律后失调对推断的微生物群功能途径丰度的影响。

备注：因受试者内部和受试者之间的变异性，SEMs增加了。PICRUSt丰度数据没有被稀释，而是以0.01%的阈值过滤。任何总丰度至少占总丰度0.01%的途径都被保留用于分析。SEM，平均值标准误差。a平均的CR度和基线CR度(CR2 - CR1)之间的差异。b用STAMP软件程序确定的两个昼夜节律之间的显著差异。c患病率是通过每个路径的丰度来确定的,除以每个函数路径的整个数据集(%)的总和。平均(CR2 - C1)/平均值(CR1)的d百分比(CR1)。

讨论

       这项原理验证研究的结果表明：人类口腔微生物群落的组成表现出内源性昼夜节律，而昼夜节律失调会显著改变口腔微生物群，并推断该变化与代谢和免疫相关的特定功能途径。虽然许多研究表明，啮齿类动物和人类的唾液和/或粪便微生物群的日常分布，但至今没有任何一项研究提供哺乳动物微生物群存在内源性昼夜节律的证据。换句话说，在食物摄入和睡眠以及日常活动、光线节律失调的情况下，微生物的节律性是否会持续存在还有待进一步确定。因此，迄今为止进行的临床前研究和为数不多的人体研究阐明了所存在的昼夜节律，内源性昼夜节律还未被得到阐明。

       有一项对肠道微生物群采样长达5年时间的，评估微生物群随时间波动的研究表明，在长时间尺度上，随着时间的推移，微生物群组成具有显著的稳定性。然而，使用更精细的时间分辨率（小时尺度上）的新兴临床前研究工作表明：肠道微生物群表现出部分受宿主进食时间控制的昼夜变化，并且宿主分子钟周期的变化导致微生物群的生态失调。由于需要严格控制昼夜节律来揭示内源性昼夜节律的真实状况，因此目前人类肠道微生物群中的内源性昼夜节律的研究尚待进一步探索。在人类中，粪便分析并不适合研究时间节律，因为它具有缓慢的时间动态，并且依赖于：胃肠运动/转运，并代表的是较长时间尺度（约8-72小时）的综合状态。

       目前，关于人类肠道微生物群的时间动态的证据非常有限。在一项试点研究中：在正常作息条件下，以12小时为间隔对直肠微生物群进行了48小时的调查性研究。与粪便/直肠样本相比，唾液样本可以更高的频率的取样，因此可以利用唾液样品来进行相关研究，可以揭示更小时间尺度上口腔微生物群落组成和功能的时间动态状况。尽管口腔和肠道（粪便）微生物群在组成和时间变化方面也存在差异，但是口腔和直肠微生物群可能存在共同的分类群。

       此外，口腔可能是与慢性炎症相关的潜在肠道病原体的储存库，而这些病原体有可能进一步加重肠道疾病。因此，如果我们对口腔微生物群有更好的见解，可能为肠道微生物群的研究提供重要的推论。在人类中，存在口腔微生物群落组成的日常节律性及其多样性，这可能与宿主的新陈代谢有关。虽然尚不清楚口腔（唾液）微生物群是否具有内在的“时钟”或昼夜节律，但我们推测很可能存在这种节律，因为口腔和肠道微生物群具有一些相同的分类群组成。目前，有新的证据表明一些肠道（粪便）微生物群显示出内在的 “时钟”和昼夜节律，并且肠道微生物群可能受到宿主昼夜节律信号的影响，比如：食物成分和时间的节律的影响。值得注意的是，通过体外培养唾液已经证明昼夜节律变化完全消除，因此表明宿主生理变化是促成微生物群的变化的主要因素。我们观察到昼夜节律对口腔微生物群落结构的影响因个体而异。尽管存在这种个体差异，但明显的内源性昼夜节律和昼夜节律失调效应（例如，β多样性）是显而易见的。β多样性研究显示，口腔微生物群中变形菌门存在内源性昼夜节律，变形菌门包含了许多促炎分类群以及参与免疫调控的链球菌属、Neisseria属和梭杆菌属。

       有趣的是，当前研究中的内源性昼夜节律发生在约20%的口腔微生物群中，而这部分类群与小鼠肠道（粪便）约20%的微生物群惊人地相似，它们的相对丰度呈昼夜有规律的波动，表明部分口胃肠道微生物群具有内源性昼夜节律。

       现代生活方式导致我们的生活行为、环境变化与我们内生的昼夜节律不一致，导致昼夜节律失调，这在夜班工人和跨时区飞行常客中很常见。在我们的研究中，固定节律允许口腔微生物群组成中内源性昼夜节律存在，因为(1)推断昼夜节律没有行为和环境掩蔽效应，以及(2)参与者处于正常对齐的昼夜节律条件下。失调后固定节律允许推断(1)先前昼夜节律失调对口腔微生物群组成的影响和(2)先前昼夜节律失调对口腔微生物群组成的内源性昼夜节律的影响。如上所述，我们的研究表明即使没有任何行为和环境节律，也存在持续存在的微生物节律，这对于经历昼夜节律失调的个体非常重要。例如，如果微生物群落节律仅由行为和环境节律驱动，那么它们将轻松快速地跟随日常行为/环境节律的变化（如轮班工人中发生的那样），而不会产生不利后果。然而，如果这些微生物群节律是至少部分独立于行为和/或环境（即由内源性昼夜节律系统）驱动，这可能解释了为什么昼夜节律失调会破坏微生物群组成。

       支持上述观点的是，我们发现即使是相对短期的实验性昼夜节律失调也会导致人类口腔微生物群组成的相对丰度发生巨大变化。这些微生物群的改变表现为：流行率最高的厚壁菌门和链球菌属的相对丰度减少（即：主要定植了被推定的有益的稳定口腔微生物），加上流行率相对较低的拟杆菌门和四种假定的益生菌的相对丰度增加。如梭杆菌和卟啉单胞菌（Porphyromonas），其相对丰度在昼夜节律失调后增加，而这类菌通常与促炎状态（如：牙周病和口腔癌和结肠癌）有关。从长远来看，频繁发生昼夜节律失调可能会导致微生物群驱动的炎症的加剧，从而对健康和疾病产生影响。此外，如图S1所示，我们没有观察到昼夜节律和昼夜节律效应对口腔微生物群门和属的相对丰度的显著相互作用，尽管一些微生物群落门/属在昼夜节律失调之后似乎表现出随昼夜节律发生降低并且似乎失去节律性等特征。因此，处于昼夜节律失调也可能对口腔微生物群组成中的内源性昼夜节律产生不利影响。然而，这些后一种影响需要在足够有力的人体实验室研究中进行重复。

       先前的基于动物实验的研究表明，环境和遗传因素对昼夜节律的破坏都会扰乱微生物群落并导致肠道通透性增加。例如，一项动物实验研究表明，环境昼夜节律紊乱改变了微生物群组成。此外，与在时差反应之前接受来自相同个体的微生物群的小鼠相比，将经历时差反应的个体的微生物群粪便进行移植的无菌小鼠在口服葡萄糖后体重增加、葡萄糖水平增加。这些发现强调了昼夜节律紊乱对微生物群的影响及其与代谢控制的功能相关性。目前，我们还需要进行进一步的研究，包括基于宿主转录组学、微生物群宏基因组学和宏转录组测序，以及代谢物分析的研究，从而了解口腔微生物群在昼夜节律失调的不利影响中的作用。

       在这项研究中，我们还通过推断的功能基因含量分析表明，昼夜节律失调降低了苯丙氨酸、酪氨酸、硫胺素和色氨酸途径，这些途径介导了氨基酸代谢和免疫翻译。相反，昼夜节律失调会增加硫生物合成途径，该途径控制特定基因的翻译，当该途径被破坏时，引起潜在的致癌物的生成。宿主昼夜节律失调影响了细菌功能基因的含量，增加了硫辛酸代谢和细胞抗原途径的丰度。这些推断的功能通路与全身炎症有关，其中过氧化物酶和PPAR信号的丰度的增加调节了全身氧化应激和炎症。因为我们在16S rRNA基因扩增子测序数据上使用了PICRUSt，所以我们只能推断宿主昼夜节律失调对口腔微生物群功能基因含量/途径的影响。因此，在解释我们报告的口腔微生物群功能研究结果的功能相关性时，我们持以谨慎的态度。为了解释上述问题，可能需要进一步使用宏基因组鸟枪法等研究来直接评估口腔微生物群功能基因含量。

我们报告的口腔微生物的内源性昼夜节律不太可能受到潜在健康状况（包括睡眠障碍）的影响。虽然没有进行临床PSG或家庭睡眠呼吸暂停测试作为筛查过程的一部分，但我们的研究中的参与者都很年轻（18-35岁），BMI值相对较低（18-28 kg/m2）。此外，在研究之前，根据临床病史、心电图、血液和尿液的临床生化筛查测试以及医生的体检，他们没有任何急性、慢性疾病或健康衰弱的症状。此外，我们观察到FD实验步骤下的昼夜节律对齐和失调条件之间的睡眠结构特征没有显著差异（表S5）。因此，细微的睡眠结构差异不太可能影响口腔微生物群组成的内源性昼夜节律。

       我们的研究优势包括：我们以严格的标准纳入/排除排除了包括综合症和药物摄入量等潜在的混杂因素，从而进行口腔微生物群组成内源性昼夜节律的严格昼夜节律实验，以及谈久了昼夜节律失调的影响。我们研究的局限性包括：样本量小，这是由于我们对参与者的严格筛选标准和实验条件的苛刻性所致。由于样本量小，我们无法对多重比较进行统计校正。因此，必须在具有足够统计功效的大型试验中重复验证这些发现。我们的余弦分析(Cosinor analysis)包括固定节律期间的七个时间点测量和失调后固定节律期间的九个时间点的测量。因此，部分昼夜节律失调效应可能是由于进入研究方案的时间所致。值得注意的是，以前的人为的强制紊乱（FD）实验结果已经表明，昼夜节律失调对代谢结果的影响是可逆的，这表明实验室研究期间的持续时间可能无法解释昼夜节律失调效应。然而，那些实验室方案和测量结果（如：葡萄糖耐受的测定）与我们的研究结果不同。因此，未来的研究需要调查观察到的对口腔微生物群组成的失调影响是否在昼夜节律调整后可以得到恢复。总的来说，这些发现表明：昼夜节律失调可能会对代谢和免疫不可或缺的特定功能途径产生不利影响。然而，因为我们的分析是仅基于微生物群的相对丰度，我们的数据并未提供表达水平上引起改变的证据。因此，需要进一步的研究来探究昼夜节律失调期间改变的宿主和微生物群基因表达模式。

结论

       人类健康与微生物群组成和功能的完整性密切相关。虽然习惯性饮食、营养素组成的变化、食物摄入时间的变化以及不可消化的膳食纤维的摄入已被证明会影响人类微生物群，但是目前尚不清楚昼夜节律失调本身是否会影响人类微生物群。总的来说，本研究为人类口腔微生物群的昼夜节律性提供了证据，并表明昼夜节律失调可以快速、显著地改变人类微生物群落组成和微生物群参与的新陈代谢和免疫的功能途径。这些发现适应于通常处于昼夜节律失调的包括夜班工人和飞行常客在内的个体。

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