ALI/ARDS间充质干细胞的临床应用

撰文│朱    峰   马少林

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床常见急危重症，其主要病理改变为肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞受损，通透性增加，富含蛋白质的液体渗出积聚于肺间质和肺泡。目前对ALI/ARDS的治疗以支持治疗为主，包括机械通气和药物治疗，其临床病死率近40%，甚至更高。随着干细胞生物学和工程学的发展，人们逐步认识到间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有“归巢”至损伤组织，在目标组织中抑制免疫及炎症反应，向多种组织细胞分化而不涉及伦理道德问题的特征，且易于分离培养和外源基因的导入、表达，免疫原性低，遗传背景稳定等特点，这使其在创伤修复、组织功能再生与重建、免疫调节和治疗等领域有着极广阔的应用前景，其机制见图1。自20世纪80~90 年代，MSCs在ALI/ARDS中的基础研究和临床试验越来越多，这次席卷全球的COVID-19将ALI/ARDS的MSCs 临床安全性和有效性的研究推向新高峰，可能为ALI/ARDS的治疗开辟新途径。

图1 各种来源MSCs治疗ALI/ARDS的可能机

一、临床前研究

1. MSCs肺内“归巢”（homing）及机制

多个早期研究显示，MSCs   可“归巢”至各种原因所致肺   损伤和炎症区域，这是干细   胞发挥功能的前提。肺损伤   后，坏死细胞可通过释放一系   列信号因子，引导表达特异性   受体的干细胞移动并黏附于损   伤处，这被认为是干细胞“归   巢”的主要机制。损伤引起干   细胞动员和归巢的信号因子主   要包括：基质细胞衍生因子-1   及其受体CXCR4、受体c-kit、   集落刺激因子、血管内皮生长   因子和整合素等，大量细胞因   子、蛋白水解酶及黏附分子等   可能也参与此过程。  

2. MSCs肺内分化及其机制

研究证实， 多种来源的MSCs在体内体外可转化为Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞，并表达肺表面活性物质相关蛋白C。笔者在用骨髓MSCs治疗吸入性损伤兔时发现，标记的骨髓MSCs能分化为Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞，并表达它们的细胞标记物。   目前对MSCs分化、修复损伤肺组织的具体机制不明确，可能是一个或多个机制共同作用的结果。研究提示，这种分化高度依赖外界环境信号和细胞内信号传递。Wnt信号通路、细胞内Ca2+ 通道、丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号，以及Rho信号通路等均可能参与了MSCs体内外的增殖与分化。  

3. MSCs肺内及全身抗炎-免疫调节作用及其机制

现有理论认为，ALI/ARDS   的实质是炎性反应和毛细血管   通透性增加的综合征，充斥大   量促炎、抗炎及免疫调节反   应。各种原因引起炎性细胞激   活和一系列炎性介质释放，造   成机体损伤，同时激活更多炎   性细胞，释放更多炎性介质或   细胞因子，使机体受损的信号   进一步放大和加强，形成炎症   瀑布效应。最近大量研究证   实MSCs可防止LPS所致的肺   水肿，减轻中性粒细胞在肺内   浸润，明显降低血浆前炎因   子水平， 如IL-1β、IFN-γ、   MIP-1α，保持抗炎因子IL-10   和G-CSF水平的稳定， 促使   G-CSF急性升高。有研究证实   通过肺内给予实验鼠内毒素造   成ALI 后4h再向肺内直接给   予MSCs，可改善实验鼠48h   生存率，减少肺水和支气管肺   泡灌洗液蛋白含量，降低肺衬   液内MIP-1水平， 升高血浆   和肺衬液内的IL-10水平。国   内有将MSCs经静脉移植ALI   大鼠体内，发现MSCs移植可   降低内毒素肺损伤大鼠血浆   TNF-α及IL-6水平，降低肺   湿/ 干重比值、髓过氧化酶活   性，减轻肺泡炎症损伤。   MSCs在ALI/ARDS中的抗炎及免疫调节作用的可能机制有：① MSCs表面表达大量受体分子， 包括CD分子、ICAM-1、VCAM-1、IL-6等多   种黏附分子的膜受体，多种整   合素亚单位、CXC趋化因子；   可分泌细胞外基质蛋白、层粘   连蛋白、波形蛋白、骨连接素   等。ALI/ARDS时， 这些信号   分子直接或间接吸附并中和机   体释放的大量炎症因子，降低   或改善炎症反应。② MSCs通   过产生可溶性细胞因子IL-Ira   等诱导T辅助淋巴细胞2（TH2）   型对内毒素的促炎反应和抗炎   反应，改变炎症因子对LPS的   反应方式，使TH1反应降低，   维持TH2炎症因子水平，因此   可下调LPS的促炎反应和促炎   因子，上调抗炎因子。③ MSCs   释放某些活性分子， 包括   M-CSF、IL-6/7/8/11/12/14/15 等，   阻断炎症信号瀑布效应，为肺   内功能细胞的修复和再生创造   环境。④ MSCs抑制免疫细胞   增殖、活化，因子的分泌及诱   导T细胞凋亡。  

4. MSCs旁分泌作用

这些旁分泌因子通过组织间隙作用于周围细胞，发挥重要的旁分泌作用，广泛参与免疫调节、细胞增殖、凋亡、内源性前体细胞再生、血管再生及释放生长因子以改变内皮细胞或上皮细胞损伤反应。MSCs旁分泌物质可能有：①生长因子及受体，包括血管生成素-1/2、VEGF、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-β等在内的多种生长因子。②细胞因子和趋化因子， 包括IL-1、IL-6、IL-10及单核细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白-1等。③调节肽及其他一些相关分子，包括钠尿肽、降钙素基因相关肽、局部肾素- 血管紧张素系统、内皮素和肾上腺髓质素等在内的多种调节肽和一些特异性活性因子，包括干细胞因子、干细胞衍生因子、干细胞衍生的神经干/祖细胞支持因子等。这些干细胞旁分泌物质在ALI/   ARDS 的治疗中发挥重要作用，   具体表现在：抗炎和免疫调节，   清除肺泡液，修复和改善受损   的肺泡毛细血管屏障结构和功   能，趋化其他细胞参与组织修   复，抗菌作用，促进血管生成，   抗凋亡，促代谢，防御反应和   组织分化等。  

5. 线粒体转移

外源性MSCs可将具有正   常功能的线粒体转移“捐献”   至损伤肺组织细胞和气道上皮   细胞并重建其功能，转移至局   部肺泡细胞的线粒体增加了局   部和邻近肺泡细胞的ATP含   量及Ⅱ型肺泡上皮细胞表面活   性物质分泌，是干细胞治疗肺   损伤的重要机制之一。线粒体   转移需通过细胞间形成的间隙   链接通道（GJCs）实现。线粒   体转移的具体机制有以下几种   假说：①在受体细胞及供体细   胞间形成隧道纳米管，主动转   运完整线粒体。②转移线粒体   DNA而非完整线粒体。③受体   细胞被动吞噬干细胞出芽产生   的含线粒体的微泡。④细胞完   整融合后选择性丢失供体细胞   核。线粒体转移不会发生在未   遭受LPS等外界攻击的正常肺，   说明对肺泡上皮组织的病理性   刺激才是线粒体转移的关键。   线粒体转移具有单向性，即从   外源性干细胞转移至受损呼吸   道细胞。多项研究证实线粒体   转移的单向性可能与连接管道   结构内微泡中的细胞骨架微丝   有关。  

6. MSCs胞外囊泡

根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）2018年发布的最新定义，细胞外囊泡为从细胞中自然释放的颗粒，根据大小、密度、表征分不同亚型， 包括凋亡小体、微囊泡及外泌体。MSCs来源的外泌体是研究较多的胞外囊泡，携带蛋白质、脂质、核酸等，传递给受体细胞，在生理病理调节中发挥组   织修复、趋化、抗炎- 免疫调节、   转移线粒体等作用。大量研究   证实，在ALI/ARDS中，MSCs   来源的外泌体在肺内局部和全   身进行炎症- 免疫调节，诱导   巨噬细胞极化，调节自噬、清   除，增强免疫反应功能的内源   性外泌体，减少细胞凋亡，减   轻缺血/再灌注损伤，降低肺   泡表面通透性，改善氧化应激   损伤和肺纤维化等。  

二、临床研究与应用

截至2021年8月20日，以“MSCs”和“ALI/ARDS”为主题词搜索，在ClinicalTrials.gov 注册的有42项临床试验，其中超过26项是涉及MSCs治疗COVID-19安全性/有效性的临床试验。此外，在中国临床注册中心（https://www.chictr.org.cn）注册的关于MSCs 治疗COVID-19的临床试验已有15项。在ALI/ARDS和COVID-19患者中注册基于MSCs的临床试验的国家和数量正逐步增加，目前数量最多的是中国和美国。

第一项MSCs治疗ALI/ARDS的临床试验是在中国进行（NCT01902082）。这是一项Ⅰ期、单中心、随机、双盲、安慰剂对照临床试验，ARDS患者静脉注射异体脂肪来源的MSCs（1×106/kg）。给药患者安全且耐受良好。在I 期安慰剂对照研究中，两组之间没有与输注细胞相关的不良反应或严重不良事件报道，治疗后28天住院时间、脱机天数相似。MSCs组第5天血清SP-D水平明显降低。第二项I期临床试验（START）在美国进行，是一项多中心、开放、剂量递增、1期临床试验（NCT017775774），对象是中- 重度ARDS患者。进行单次静脉注射异体骨髓MSCs（1×106/kg，5×106/kg和10×106/kg），未观察到呼吸不良反应，氧合指数改善，血浆ANG-2水平降低，表明干细胞减轻了内皮损伤。在一项后续研究中（NCT02097641），对2例严重难治性ARDS患者的免疫调节和蛋白质组学特征进行了详细分析。2例患者均为2×106/kg治疗剂量，患者呼吸、血流动力学和多器官衰竭均有改善。与此同时，各种肺和全身炎症标志物，包括上皮细胞凋亡、肺泡毛细血管液渗漏、促炎因子和趋化因子有所下降。笔者团队开展的脐带间充质干细胞注射剂治疗吸入性肺损伤的随机、双盲、单中心、安慰剂平行对照临床研究（ChiCTR1900020919）目前所招募的患者初步结果显示安全性良好。

近年，由于COVID-19的蔓延和肆虐，使得干细胞治疗再次被高度关注。根据国际干细胞研究学会的数据，目前还没有被批准的干细胞疗法治疗COVID-19。但基于MSCs已确定为一种能够控制“细胞因子风暴”和放大免疫反应的治疗选择，以及来自不同器官或供体MSCs的ACE2和TMPRSS2呈阴性（这表明MSCs不易被COVID-19感染），干细胞和再生医学已经将MSCs作为治疗COVID-19的有效方法之一。

一项早期研究表明，人MSCs治疗对1例65岁罹患COVID-19危重患者的免疫反应和组织损伤修复的安全有效性。UC-MSCs静脉注射3次（50×106/次，3天/次），第二次UC-MSC给药后，实验室参数和生命体征明显恢复。此后，白细胞和中性粒细胞计数下降至标准水平，淋巴细胞数量增至正常值。另一项涉及7例COVID-19患者（1例出现严重危重类型，4例出现严重类型）研究中，接受静脉注射1×106/kg MSCs，单次注射MSCs后未见明显不良反应；接受MSCs 注射的患者在输注后2~4天，临床和分析终点有所改善，病毒滴度降低。这项研究提示COVID-19患者注射MSCs后有较强抗炎作用，这导致了白细胞和中性粒细胞计数减少，C反应蛋白下降了10倍，免疫细胞数和TNF-α水平下降；相比之下，外周血中淋巴细胞、调节性树突状细胞数量和IL-10水平增加。

三、展望  

从大量基础研究和有限临床试验结果看出，MSCs治疗各种原因引起的ALI/ARDS安全性良好，对改善症状和恢复肺功能具有一定效果，是ALI/ARDS极具前景的治疗措施。然而，MSCs 治疗ALI/ARDS也有诸多临床问题需解决，比如MSCs最佳治疗剂量，MSCs最有效给予途径及成瘤效应等远期副作用。目前临床试验大多处于1~2期，MSCs治疗ALI/ARDS的科学性、合理性需要更多数据和结果的支持。 

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