益生菌通过靶向调节肠-心/脑轴为冠心病患者带来额外益处

编译：微科盟九卿臣，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

尽管最近针对冠状动脉疾病（CAD）的药物治疗（如他汀类药物）等治疗策略方面取得进展，但是与CAD相关的死亡率和发病率仍然很高。越来越多的证据表明，肠道菌群失调可能与冠心病等心血管疾病有关。肠道菌群已被证明会影响宿主的生理过程。肠-心轴是心血管疾病研究领域中提出的一个新概念，肠道菌群和心脏间的双向作用为治疗CAD开辟了创新和有前景治疗方案。因此，通过益生菌来靶向调节肠道菌群/代谢物可能是一种很有前途的治疗CAD方法。然而，益生菌疗法在CAD治疗中存在菌株特异性，因此有必要评估新的候选益生菌菌株在CAD治疗中的效果。

本研究旨在评估与传统治疗方案相比，乳双歧杆菌Probio-M8辅助治疗对CAD患者治疗的额外效果。在试验期间采集患者粪便样本、血液及临床指标。结果表明，常规治疗后患者西雅图心绞痛量表（SAQ）评分明显改善，值得注意的是，与安慰剂组相比，在180天时益生菌辅助治疗患者的SAQ评分改善更明显（P<0.0001）。此外，益生菌治疗更有利于缓解患者焦虑、抑郁症状（P<0.0001，180天时与安慰剂相比），血清中白细胞介素-6（IL-6）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平显著降低（分别为P<0.005, P<0.001）。对粪便宏基因组进行深入分析发现，在180天时，与安慰剂组相比，益生菌组患者肠道中Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum和Butyricicoccus porcorum的丰度显著增加，Flavonifractor plautii 和 Parabacteroides johnsonii的丰度显著降低（P<0.05）。此外，在干预期间/后，益生菌组比安慰剂组中有更多的生物活性代谢物（如甲基黄嘌呤和丙二酸），且三甲胺-N-氧化物和导致动脉粥样硬化的氨基酸浓度降低（P<0.05）。综上所述，益生菌Probio-M8联合常规疗法可以提高CAD治疗效果，其潜在机制可能是益生菌通过调节宿主肠道菌群和代谢组，从而改善微生物代谢潜力和血清代谢谱，同时强调了肠-心/脑轴在CAD治疗中的意义。

论文ID

原名：Bifidobacterium lactis Probio-M8 adjuvant treatment confers added benefits to patients with coronary artery disease via target modulation of the gut-heart/-brain axes

译名：乳双歧杆菌Probio-M8通过靶向调节肠-心/脑轴为冠心病患者带来额外益处

期刊：mSystems

IF：6.496

发表时间：2022.3.28

通讯作者：张和平

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点试验室

DOI号：10.1128/msystems.00100-22

实验设计

本研究进行一项为期180天的随机、双盲、安慰剂对照临床试验。招募71名冠心病患者（表S1），随机分为益生菌组（Pro；37人）、安慰剂组（Pla；34人）。益生菌组患者每天服用20mg阿托伐他汀片和美托洛尔联合Probio-M8菌粉（每包2g，3×1010 CFU/包/d），安慰剂组每天服用20mg阿托伐他汀片和美托洛尔及等剂量安慰剂，持续180天。分别在第0、90、180天采集患者粪便和血液样品，在第0、180天填写调查问卷并记录患者临床指标（包括SAQ、SAS、RBT、IL-6、LDL-C、谷丙转氨酶、血尿素氮和肌酐等指标；图S1）。用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 提取粪便总DNA，使用Illumina HiSeq 2500对DNA样品进行宏基因组测序。

图1 实验设计示意图 （原文中图1a）。

前言

冠状动脉疾病（CAD），又称冠心病（CHD），是指冠状动脉狭窄和供血不足引起的心肌功能障碍和/或器质性病变，是一种常见的心血管疾病（CVD）。尽管目前CAD在医学和治疗策略方面取得进展，但与CVD相关的发病率和死亡率仍然很高。目前他汀类药物被广泛应用于治疗血脂异常和动脉粥样硬化等疾病，但该类药物会产生严重的副作用（如横纹肌溶解症、肝毒性和新发糖尿病）。

研究表明肠道菌群及其衍生代谢物（如短链脂肪酸、氧化三甲胺、胆汁酸等）与CAD发病有关。肠道菌群与心脏间的双向作用会影响宿主内环境稳态，而这也意味着应用益生元、后生元制剂，以肠道菌群及其代谢产物为靶点的益生菌疗法将成为预防和改善CAD患者生活质量的一种新型治疗方法。越来越多的证据表明益生菌可以缓解与免疫系统、肥胖和心血管健康有关的疾病。研究发现，棒状乳杆菌CECT5711可以改善肥胖小鼠内皮依赖性血管舒张，降低血管氧化应激反应；罗伊氏乳杆菌V3401能有效降低肥胖成人患CVD的风险；动物双歧杆菌Bb12能够降低孕妇血清总胆固醇和甘油三酯水平。这些结果表明通过外源益生菌对肠道微生物进行靶向操作可能是改善冠心病治疗效果的一种新途径。由于Probio-M8与动物双歧杆菌Bb12菌株属于同一亚种，预计会产生类似降血脂效应。然而，由于益生菌菌株特异性所产生的功能特异性，因此，有必要评估新的候选益生菌株在CAD治疗中的效果。

他汀类药物和益生菌都能有效改善CAD相关症状，但关于两者联合使用效果的研究比较少。因此，本研究的主要目的是进行一项随机、双盲、安慰剂对照试验，研究益生菌辅助常规药物对CAD治疗的协同效应，以及进一步探索改善患者症状的潜在机制，基于益生菌的应用为CAD的发病机制和治疗提供广泛的参考信息。

实验结果

1 益生菌辅助治疗改善了冠心病相关临床症状

干预180天后，益生菌组和安慰剂组患者西雅图心绞痛量表（SAQ）评分均显著提高，抑郁（SAS）和焦虑（SDS）评分显著降低（P<0.01）。但与安慰剂组相比，益生菌组SAQ评分提高更显著（P<0.0001），心绞痛频率（AF）、心绞痛稳定性（AS）、活动受限程度（PL）和治疗满意度（TS）指标分别增加了1.14倍、1.13倍、1.17倍和1.08倍。此外，两组患者血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、白细胞介素-6（IL-6）水平均显著降低（P<0.01）。与安慰剂组相比，益生菌组患者LDL-C和IL-6水平显著降低（P<0.005；图2）。另一方面，两组间谷丙转氨酶、血尿素氮、肌酐和白细胞计数水平均无显著差异（P>0.05）。但是在6个月随访期间发现，益生菌组不良事件发生率显著低于安慰剂组（分别为15.7%和25%；P<0.05；表S3）。以上结果表明，益生菌联合药物治疗和传统疗法均可有效缓解CAD患者临床症状，且益生菌辅助治疗显著改善了CAD相关临床症状，减少了不良事件的发生。

图2 冠心病相关临床指标。在益生菌组和安慰剂组间采用Wilcoxon检验；在第0天和第180天纵向比较采用配对T检验。所有指标均采用Benjamini-Hochberg多重校正，P<0.05为有显著差异。（SAS：焦虑自评量表得分；SDS：抑郁自评量表得分；IL-6：白细胞介素-6；LDL-C：低密度脂蛋白固醇）（原文图1b）。

 2 CAD患者肠道菌群的基因组特征

对41名受试者在第0、90和180天采集的123个粪便样本进行深入的宏基因组分析。通过使用MetaBAT2、VAMB和DAS tools等bin细化工具，共获得10977个宏基因组组装基因组（MAG），其中有2972个高质量MAGs，569个中质量MAGs和654个低质量MAGs。从这些高质量MAGs中共提取出440个SGBs（分布于13个门，20个纲，26个目，41个科，83个属和281个种）。其中厚壁菌门（70.68%）最多，其次为拟杆菌门（11.59%）、放线菌门（6.59%）和变形菌门（7.95%）（表S4）。

 3 益生菌辅助治疗可调节患者肠道菌群组成

为评估摄入益生菌对CAD患者肠道菌群的影响，通过Alpha（以Shannon指数表示）和Beta（以主坐标分析（PCoA）、Bray-Curtis距离表示）多样性分析发现，在干预期间，两组Shannon多样性指数无显著变化。同样，PCoA分析显示，两组患者在不同时间点肠道菌群结构也没有显著差异（P>0.05；图3a-b）。虽然干预后两组肠道菌群整体多样性和结构没有明显变化，但发现一些第0天时在益生菌和安慰剂组中没有显著差异，而在后续时间点或两组间有显著差异的关键SGBs（表S5）。

干预期间，在益生菌组中有8种SGBs的丰度显著增加，包括B. adolescentis, B. animalis, B. bifidum和Ruminococcaceae bacterium，而Roseburia inulinivorans和 Eubacterium sp. CAG:115 丰度显著降低（P<0.05）。然而，安慰剂组在整个干预过程中没有显著变化的SGBs，这可能是在宏基因组分析中，益生菌组和安慰剂组间样本量有差异的结果，与益生菌组（n=24）相比，安慰剂组（n=17）样本量较少，统计能力也相对较低。干预结束时，在两组间有21个丰度差异显著的SGBs。与安慰剂组相比，益生菌组有17个SGBs丰度显著增加，包括Butyricicoccus porcorum, Eggerthella sp. CAG:298和B. adolescentis，而Parabacteroides distasonis, P. johnsonii, Bacteroides uniformis和Flavonifractor plautii 丰度显著下降（P<0.05；图3c）。

图3 患者粪便宏基因组数据的微生物多样性和物种水平基因组SGBs特征。益生菌组（a）和安慰剂组（b）在0、90、180天的Shannon多样性指数和主坐标分析（PCoA）。（c）在不同时间点益生菌组和安慰剂组中发生显著变化的SGBs（原文中图2）。

4 患者肠道菌群与临床特征的多变量关联分析

为揭示干预引起肠道菌群的改变是如何影响临床特征，以及干预过程中两者间的相互关联，我们进行了效应量（通过Adonis分析计算）和多变量关联分析。结果发现，与安慰剂组相比，益生菌组患者肠道菌群解释了更大的临床指标差异（Pro：0.458；Pla：0.041），分别对应23个和4个显著SGBs（图S1b）。此外，55个SGBs与患者临床指标显著相关，包括uncultured Clostridium sp., Roseburia inulinivorans, B. adolescentis, Eubacterium sp. CAG:115, Clostridiales bacterium 和B. animalis。在这些SGBs中B. animalis，Clostridium sp与LDL和SDS呈显著负相关；Eubacterium sp. CAG:115, B. adolescentis与LDL和PL呈显著正相关；Roseburia inulinivorans与IL呈显著正相关而与PL呈显著负相关（图S1c）。这些结果共同表明，益生菌通过影响特定物种变化从而对临床指标产生影响，益生菌辅助治疗对临床特征的影响比单独使用传统药物治疗更显著。

5 益生菌辅助治疗可调节肠道微生物编码的代谢模块

为了识别440个SGBs编码的代谢模块，利用MetaCyc和KEGG数据库构建了以基因组为中心的代谢重建。结合临床表型，主要鉴定到4个模块组，即碳水化合物降解模块（CDM，21个模块；图4a）、冠心病模块（CHM，25个模块；图4b）、肠脑代谢模块（GBM，60个模块；图4c）和氨基酸降解模块（ADM，32个模块；图4d）。研究结果表明，在这138个模块中，有121个模块被SGBs有效编码。鉴定出的模块属于13个门，主要分布在厚壁菌门（70.68%）、拟杆菌门（11.59%）和变形菌门（7.95%）。半乳糖降解（65.91%）、乳糖降解（65.91%）、N-乙酰-D-葡萄糖胺6-磷酸代谢（99.55%）和半胱氨酸降解（94.32%）是4个模块组中最常见的编码模块（表S6）。值得注意的是，在CHM模块组中，与膳食胆碱相关的代谢途径主要由与胆碱和肉碱降解相关的模块编码，以34个SGBs为代表，主要属于厚壁菌门（44.12%）和变形菌门（41.18%）。GBM模块组编码了大量与短链脂肪酸（SCFAs）相关的代谢模块，这些模块由高度多样性的SGBs编码，有426、94和167个SGBs分别参与乙酸合成、γ-氨基丁酸（GABA）代谢和皮质醇降解。值得注意的是，以上4个模块组（CDM、CHM、GBM、ADM）在0、3和6个月时，益生菌和安慰剂组间的总累计丰度没有显著差异（图S2）。

图4 以CAD患者基因组为中心的代谢重建。共识别到4个代谢模块组，包括（a）碳水化合物降解模块（CDM），（b）冠心病模块（CHM），（c）肠脑代谢模块（GBM）和（d）氨基酸降解模块（ADM）。弦状图上半部分显示了种水平的基因组SGBs的分布，弦状图下部分表示编码模块（原文中图3）。   

6 益生菌辅助治疗可调节肠道生物活性化合物

为识别益生菌对肠道生物活性化合物的特异性调节，进一步分析了益生菌和安慰剂组中差异显著SGBs编码的代谢模块（图5）。研究结果表明，在干预期间/后，益生菌组中有更多SGBs参与色氨酸合成和GABA代谢。肠脑代谢组（GBM）中的4种模块（包括皮质醇降解、乙酸、异戊酸和多不饱和脂肪酸合成）在益生菌组中占主导，这些模块中SGBs的多样性和丰度更高。而乙酸降解模块在安慰剂组中更多。相比之下，冠心病模块组中的N-乙酰-D-葡萄糖胺6-磷酸和甘露醇代谢在安慰剂中占主导。此外，在180天时，安慰剂组中检测到更多编码胆碱降解的SGBs。在氨基酸降解模块组中，与蛋氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸降解相关SGBs在益生菌组占主导。而安慰剂组中有更多样的SGBs参与组氨酸合成和更高丰度的模块参与天冬氨酸降解。

有趣的是，益生菌组中更高比例的SGBs参与精氨酸降解V，而安慰剂组中参与精氨酸降解I和IV的SGBs比例更高。在干预期间/后，益生菌组中有更多SGBs参与蔗糖和阿拉伯糖降解，安慰剂组中有更多模块参与乳糖降解，主要由Bacteroides uniformis 和P. johnsonii编码。此外，益生菌组中以淀粉、蜜二糖和果糖降解模块为主（以较高多样性SGBs和较高丰度模块为特征），而糖降解模块中的木糖降解模块在安慰剂组中丰度较高（图5）。

图5 益生菌和安慰剂组在不同时间点的肠道代谢模块的变化。柱状图表示两组在不同时间点识别出的反应性SGBs的丰度，下方显示了益生菌组和安慰剂组种水平上的差异SGBs在4个模块中的分布（原文中图4a）。

7 益生菌辅助治疗可调节肠道生物活性代谢物

通过MelonnPan对患者肠道生物活性代谢物进行预测，共预测到80种代谢物。其中8种代谢物在0天时两组间差异不显著，在干预期间/后成为差异代谢物（表S7）。与安慰剂组相比，益生菌组中X3甲基黄嘌呤、胞嘧啶、丙二酸和棕榈酰甘油水平显著增加，而C20:4肉碱水平显著降低（P<0.05，图6）。以上结果表明，益生菌辅助治疗会使某些特定预测代谢物发生变化，反映了不同组肠道菌群在合成这些代谢物潜力的差异。

图6 益生菌和安慰剂组在不同时间点的肠道预测代谢物的变化。益生菌辅助治疗对差异肠道生物活性代谢物水平的影响（原文中图4b）。

8 益生菌辅助治疗可调节血清代谢物

为了确定CAD相关变化的潜在生物标志物，通过靶向代谢组学对25个血清代谢物（包括TMA、TMAO和23种氨基酸）进行定量检测（表S8）。结果表明，益生菌干预可同时降低患者血液中TMA（特别在第90天；P<0.01）和TMAO水平（180d vs 0d和90d；P<0.05）。此外，干预180天后，安慰剂组TMAO水平显著高于益生菌组（P<0.001）。与安慰剂组相比，益生菌组患者血清中2种氨基酸（L-丝氨酸和L-甘氨酸）水平显著上升，其余4种氨基酸（L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸和L-精氨酸）水平显著下降（P<0.05）。益生菌组血清中天冬酰胺水平显著升高，安慰剂组中犬尿氨酸水平显著升高（P<0.05）。最后，与第0天相比，第90天时，益生菌组患者血清中L-蛋氨酸水平显著降低，而安慰剂组血清中L-蛋氨酸水平显著升高（P<0.05；图7）。

图7 CAD患者血清代谢组变化。（a）益生菌和安慰剂组血清代谢物（三甲胺、氧化三甲胺和特定氨基酸）的水平在不同时间点的比较。（原文中图5a）  

讨论

肠道菌群已被证明会影响宿主的生理，某些情况下，肠道生物活性代谢物会通过血液循环进入心血管系统而导致疾病的发生（如炎症性肠病、哮喘、焦虑和肥胖等疾病）。本试验探究了益生菌Probio-M8与传统治疗方案（阿托伐他汀和美托洛尔）联合应用于CAD治疗的效果和机制。结果发现，干预期间/后，仅传统疗法就足以改善CAD相关临床症状，但益生菌辅助治疗改善效果更显著。患者SAQ评分明显高于单独应用常规疗法的患者，显著缓解患者焦虑和抑郁症状。同时，益生菌干预后患者血清中IL-6、LDL-C水平显著低于安慰剂组。两组患者在这些临床指标上的显著差异，提示益生菌协同常规药物能提高CAD临床治疗效果。 在干预不同阶段采集患者粪便样品应用宏基因组测序并进行生物信息学分析，监测益生菌干预期间/后肠道菌群动态变化。益生菌组和安慰剂组在任何时间点粪便微生物多样性没有显著差异。PCoA分析（基于Bray-Curtis 距离）结果也没有显示特定聚类模式。Alpha 和 Beta 多样性分析结果表明，本研究中所观察到的症状缓解效果不是由于肠道菌群多样性变化引起的，而是一些特定SGBs丰度发生显著变化导致的。一些潜在有益的SGBs，如B. adolescentis, B. animalis, Butyricicoccus porcorum, Lachnospiraceae bacterium, Ruminococcaceae bacterium, Subdoligranulum sp. 60_17, Eubacterium sp. CAG:76和 Roseburia sp. CAG:197的丰度在干预后显著增加，而P. johnsonii, Bacteroides uniformis和 F. plautii的丰度显著降低。Roseburia, Eubacterium和Lachnospiraceae bacterium是重要的产丁酸盐菌，可以增加盲肠中丁酸盐水平。丁酸盐作为一种信号分子与特定受体结合，通过内分泌系统、神经系统、免疫系统和心血管系统调节肠道内稳态并参与其它重要的宿主生理活动。 肠道菌群组成的变化会影响肠道代谢物的水平，某些代谢产物会被肠道吸收并运输到血液循环系统，进而对宿主产生生理效应。研究结果表明，益生菌辅助治疗提高了肠道菌群产生活性代谢物的水平，并调节了某些代谢模块和血清代谢组。在干预后，益生菌组患者肠道中有更多SGBs参与色氨酸合成和GABA代谢。色氨酸作为一种胞间信号，其代谢产物可以改善肠道炎症、神经元功能和粘膜免疫。而GABA是一种神经递质，它通过肠脑轴在缓解焦虑和抑郁等精神障碍中发挥作用。同时，益生菌组中参与GABA合成的物种（如Bifidobacterium, Megamonas和Eggerthellaspp）丰度显著高于安慰剂组。此外，益生菌组中参与皮质醇降解、乙酸、异戊酸和多不饱和脂肪酸合成模块占主导，而乙酸降解模块在安慰剂组中更多。皮质醇是与焦虑抑郁相关的主要应激激素，补充Bifidobacterium和Lactobacillus被认为是治疗焦虑和抑郁等精神类疾病的替代疗法。另一组神经活性分子如短链脂肪酸，特别是乙酸、丁酸和丙酸，可以直接或间接参与肠-脑轴的交流。因此，益生菌Probio-M8辅助治疗可能通过肠-脑轴向内分泌、迷走神经和肠道神经系统传递信号分子从而改善患者的焦虑抑郁症状（图8）。 肠道菌群可以作为一个虚拟的内分泌系统，通过代谢途径和生物分子（如TMA、TMAO、SCFAs和胆汁酸等）调节远端器官。在本研究中，安慰剂组在90天时，C20:4肉碱水平显著升高，第180天时，参与胆碱降解III的SGBs丰度显著升高。相反，与基线相比，益生菌辅助治疗显著降低了血清TMA和TMAO水平，且干预后，益生菌组患者TMAO水平显著低于安慰剂组。TMAO是一种肠道菌群代谢物，血浆TMAO水平升高与冠心病患者主要不良心血管事件的发生率增加相关。我们的发现证实了摄入益生菌可以降低CAD患者出现心血管事件的风险，其潜在机制可能是通过降低血浆TMA和TMAO浓度 （图8）。 一些氨基酸已被鉴定为心血管疾病新的生物标志物。支链氨基酸（如：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）因其在心血管疾病高危人群中血浆水平较高而受到广泛关注。我们的研究发现，益生菌组患者血清中L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸和L-精氨酸水平显著降低。除了支链氨基酸，其它几种氨基酸，包括蛋氨酸、半胱氨酸和精氨酸可以通过不同机制促进人体和动物模型中动脉粥样硬化的发生，削弱抗氧化活性，增加脂质过氧化等。此外，益生菌干预显著提高了患者血清中L-丝氨酸和L-甘氨酸水平。L-丝氨酸被认为是一种抗氧化剂和细胞保护分子，而甘氨酸与疑似心绞痛患者发生急性心肌梗死的风险呈负相关。因此，摄入益生菌Probio-M8后，血清中这些氨基酸浓度的增加可能是预防心血管疾病的一部分潜在保护机制。

图8 益生菌驱动的调节肠-心、脑轴途径的模型（原文中图5b）。

结论

本研究表明，与传统治疗方案相比，益生菌Probio-M8联合治疗对CAD患者治疗效果更明显。其有益作用可能是通过影响患者肠道微生物组和代谢组来实现，而这反过来又调节了肠-心轴、肠-脑轴等多种途径。例如，通过增加抗炎性肠道菌群种类的多样性和丰度，降低血清中TMAO/TMA水平，并调节特定氨基酸的生物活性代谢物的水平，同时，相应的代谢模块也受到益生菌Probio-M8的调控。综上，我们的研究支持了益生菌治疗与传统治疗协同可有效减轻CAD等内脏/心脏相关疾病的症状。