多重PCR的优越性及多重应用

多重PCR（multiplex PCR） 是在普通PCR基础上加以改进，在同一个PCR反应体系中加入多对引物，同时检测多个目的基因的表达情况。而新一代基因片段分析通过将多重荧光PCR和毛细管电泳分离技术巧妙的结合，可在一个反应中同时对多种PCR产物进行定量分析。

自新冠疫情以来，对呼吸道病原体的鉴别诊断愈来愈受到重视。一项对武汉地区8274例受检者的新型冠状病毒检测及其合并感染的结果分析中， 新冠阳性组中其他呼吸道感染阳性率为5.77%，新冠阴性组中其他呼吸道感染阳性率为18.39%。

国家卫健委印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）（国卫办医函〔2020〕680号）》指出：“新冠肺炎主要与其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别，尤其是对疑似病例要尽可能采取包括快速抗原检测和多重荧光PCR核酸检测等方法，对常见呼吸道疾病进行检测”。

因此，加强病原体鉴别诊断技术的研究，提高对病原微生物检测的能力，发展能同 时检测数十种病原体的检测技术，是防控工作的重要一环。 针对病原微生物设计多重荧光 PCR 毛细电泳片段分析体系，对病原体检测具有较高的灵敏度和特异性，而且该技术易于普及，不断地推广应用，将会对新发传染病的防治带来好处   。

王乐等人报道了一种多重荧光PCR毛细电泳片段分析方法，可在一个反应中同时检测20种呼吸道常见病毒，且无交叉反应，特异性较好。文章比较了毛细电泳片段分析法和qPCR法的临床阳性样本检出率，结果发现与毛细电泳片段分析法相比，qPCR法对于混合感染样本更容易出现漏检情况，而毛细电泳法的病原体检出率更高。

张海邻等的研究发现多重荧光PCR毛细电泳片段方法具有比直接免疫荧光法更高的灵敏度（58.37%vs41.53%）。

Wei等人比较了毛细电泳片段分析法（SureX HPV test ）和qPCR方法（Cobas 4800 test和Venus HPV test ）对临床样本的检测效果，结果表明与qPCR方法相比，毛细电泳片段分析法对临床样本检测的假阳性和假阴性率更低。在进行相同样本检测时，多重荧光PCR毛细电泳片段分析法需要的扩增循环数更低。

注：图中3条曲线分别代表三个样本的qPCR反应曲线，以灵敏度较高的Ct值为29的样本为例，qPCR方法在29个扩增循环数时可检测到该样本，而多重荧光PCR毛细电泳片段分析法只需要25个循环数即可检测到该样本。

Li等对比该方法与液态芯片技术对于临床样本检测的效果，结果表明，无论在单一病原感染还是多病原感染的病原学诊断方面，多重荧光PCR毛细电泳片段分析法的灵敏度和特异度均较高。

研究人员也对可能的原因进行了探讨，一方面，两种技术前期都要经过多重PCR扩增，引物二聚体在PCR产物中的比例较高，这会影响芯片杂交的效率。但在 多重荧光PCR毛细电泳片段分析中，引物二聚体片段较短， 出峰时间较早，不会对后续特征峰造成干扰。另一方面， 基于毛细电泳的多重PCR方法分辨力极高 ，甚至相差1bp的DNA片段都能分开，且发生等位基因突变时，出峰位置也会有时间差别，检测的特异性较高。同时，多重PCR片段分析法通过不同长度引物的设计组合能明显看出杂峰的出峰位置，方便对体系进行优化。 该技术在病原学检测中 ，能放大检测同一个样本里的多种病原，因而在临床应用中受到广泛关注。

孟俊等通过多重荧光PCR毛细电泳片段方法对9457例妇女的宫颈脱落细胞进行HPV基因分型检测，结果发现，总感染率为14.36%（1358/9457），其中多型别感染占19.81%，部分患者甚至是三重感染甚至五重感染，为宫颈癌的预防、筛查、诊治及随访提供重要的依据。

刘宇奇等通过多重荧光PCR毛细电泳片段分析方法对长春地区儿童呼吸道感染病进行流行病学分析，结果表明，13种呼吸道病原检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别达到97.31%、100%、100%和99.85%，且整个试验过程耗时短、时效性好（4 h之内最多可完成192例样本检测）、检测项目全面，涵盖儿童呼吸道感染常见的病毒，满足大规模样本的多病原检测，为呼吸道感染病原学诊治提供科学依据。

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编辑 | 骆秉涵 王迪