结直肠癌西妥昔单抗治疗耐药和转移的新线索MIR100HG调控回路研究

转自：空军军医大学研究生院

导语

       空军军医大学博士研究生刘浩在结直肠癌靶向治疗耐药研究领域取得突破性进展。研究成果以“lncRNA MIR100HG与hnRNPA2B1的相互作用促进TCF7L2 mRNA的m6A依赖性稳定和结直肠癌进展（Interaction of lncRNA MIR100HG with hnRNPA2B1 facilitates m6A-dependent stabilization of TCF7L2 mRNA and colorectal cancer progression）为题发表于《分子肿瘤学》（Mol Cancer，IF:27.4）。上述研究揭示了结直肠癌EGFR单抗治疗耐药的表观遗传学新机制，为临床预测和逆转EGFR单抗耐药提供了新思路、新策略。研究受到了国家科技支撑计划项目、国家自然科学基金优秀青年基金项目和国家自然科学基金面上项目等的资助。

研究背景

       分子靶向治疗是目前肿瘤治疗的新兴领域，可极大提高晚期结直肠癌（colorectal cancer, CRC）患者的生存。西妥昔单抗 (cetuximab) 是靶向表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor， EGFR) 的治疗性单抗，也是FDA和EMA批准用于治疗KRAS/BRAF/NRAS 野生型晚期CRC的一线分子靶向药物。但在临床实践中，大部分患者对西妥昔单抗的治疗应答不超过 1 年，之后将发生获得性耐药，致病情进展。前期，本团队建立了西妥昔单抗耐药的三维 (three-dimensional，3D) 细胞模型，在体外和体内实验中成功模拟了西妥昔单抗耐药表型。发现MIR100HG基因第三个内含子所产生的miR-100/125b能靶向 Wnt通路中 5 个负性调控分子，从而促进 Wnt 通路活性增强，通过信号通路补偿方式介导西妥昔单抗耐药, 相关成果2017年以长文形式发表于Nature Medicine（IF:32.6）。但是，MIR100HG作为长链非编码RNA本身能否够独立发挥作用，其具体机制尚不清楚。

最新成果

       本研究首次揭示了MIR100HG能以非miRNA依赖的方式促进结直肠癌细胞的上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）, 西妥昔单抗耐药和转移等恶性表型。

其机制是，MIR100HG 与RNA结合蛋白核内不均一核糖核蛋白A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，hnRNPA2B1）相互作用共同维持Wnt通路关键转录因子TCF7L2 (Transcription Factor 7 Like 2) mRNA的稳定性。并且hnRNPA2B1结合TCF7L2 mRNA依赖于其m6A 修饰识别功能和MIR100HG的分子支架作用。有意思的是，TCF7L2能直接转录激活MIR100HG的表达，从而构成了一个正反馈调控环路。更重要的是，在临床结直肠癌西妥昔单抗治疗前后样本以及转移样本中MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2正反馈调控轴的存在得到了验证，这为开发临床预测和干预手段提供了理论支持。

要点一

图1. MIR100HG促进了CRC西妥昔单抗耐药过程中EMT的发生

       在3D培养条件下，西妥昔单抗耐药细胞相对于敏感细胞呈现更明显的间充质细胞表型，而上皮细胞表型减弱甚至消失，提示在西妥昔单抗耐药过程中发生了EMT。随后的生物信息学分析和功能实验表明，MIR100HG与CRC的EMT密切相关，促进了EMT的发生。

要点二

图2：hnRNPA2B1是MIR100HG的直接相互作用蛋白和功能效应分子

       通过ChIRP实验联合质谱分析以及RIP实验明确了hnRNPA2B1是MIR100HG的直接相互作用蛋白。随后的MIR100HG截短体 pull down实验和hnRNPA2B1截短体RIP实验确定了MIR100HG和hnRNPA2B1的相互作用区域。功能挽救实验表明MIR100HG通过hnRNPA2B1发挥作用。

要点三

图3. hnRNPA2B1结合TCF7L2 mRNA依赖于m6A修饰和MIR100HG

       meRIP实验证实TCF7L2的mRNA存在m6A修饰，并且+2133位点是最主要的修饰位点。RIP实验和S1m-tagged TCF7L2 pull down实验证实TCF7L2 mRNA特定位点的m6A修饰是其被hnRNPA2B1结合的前提。双荧光素酶报告基因实验进一步明确hnRNPA2B1结合TCF7L2 mRNA依赖于m6A修饰和MIR100HG的协助。

要点四

图4. MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2在CRC临床样本中的表达模式

       利用RNAscope®荧光原位杂交和免疫组织化学染色技术检测CRC西妥昔单抗治疗前后样本和配对的癌旁、原发灶和淋巴结或远处转移灶组织中MIR100HG，hnRNPA2B1和TCF7L2的表达，发现MIR100HG, hnRNPA2B1和TCF7L2在西妥昔单抗治疗后相较于治疗前显著升高，在转移灶中的表达也明显升高，并且MIR100HG和hnRNPA2B1与TCF7L2的表达呈显著正相关。

作者心得

       本研究的创新性主要体现在以下两个方面：

       一是聚焦临床热点问题，研究成果具有较好的转化价值。目前，国际上关于抗EGFR靶向治疗耐药的研究大多集中在基因层面的改变，如获得性KRAS/BRAF/NRAS 突变、EGFR突变、HER2、MET扩增等。据Nature报道，尚有17%的靶向药耐药患者，找不到具体的耐药机制，且少有涉及表观遗传学水平改变的非突变机制报道。我们最近及之前的研究揭示了MIR100HG及其衍生的miR-100/125b调控的Wnt/β-catenin通路活性增强是导致结直肠癌患者EGFR单抗耐药的重要原因。靶向Wnt/β-catenin通路联合抗EGFR治疗在临床前模型中已展现出良好的治疗效果，有望成功用于临床。同时，通过液体活检技术，动态监测MIR100HG以及miR-100/125b的水平，可能成为预测EGFR单抗耐药的理想方式。

       二是运用前沿研究方法，深入剖析临床现象背后的分子机制。本研究利用较为先进的3D细胞培养模型，相较于2D细胞模型，更贴近人体真实内环境，研究结果更具代表性。我们综合运用ChIRP，RIP，RNA pull down，ChIP，meRIP和CRSPR/Cas9基因敲除等实验方法，抽丝剥茧，层层深入，揭示了MIR100HG/hnRNPA2B1/TCF7L2这一正反馈调控轴的存在以及各分子之间的相互作用方式和机制，涉及到转录调控、转录后调控和表观遗传调控等多个方面。本研究涵盖细胞水平、动物水平和临床水平等多个维度，使得实验结果和文章结论具有较高的可靠性。

专家点评

       刘浩的研究是我们团队前期工作的延续，聚焦于靶向药物耐药的表观遗传学新机制。团队在之前发表的Nature Medicine发现，MIR100HG来源的miR-100/125b通过靶向DKK1, DKK3, ZNRF3, RNF43 和APC2等5个负性调控分子促进Wnt通路，通过旁路激活途径促进西妥昔单抗耐药。本研究进一步发现lncRNA MIR100G通过与hnRNPA2B1结合，增加Wnt通路下游关键转录因子TCF7L2的mRNA的稳定性，从而激活Wnt通路。基于此研究结果，提出一种新的分子调控模式：MIR100HG和miR-100/125b分别通过作用于Wnt通路的不同水平协同激活Wnt通路活性，且这一模式在临床样本中得到证实。这一发现为临床预测和逆转靶向药物耐药提供了潜在靶点，具有很强的转化应用前景。

原文速递

Liu H, Li D, Sun L, et al. Interaction of lncRNA MIR100HG with hnRNPA2B1 facilitates m6A-dependent stabilization of TCF7L2 mRNA and colorectal cancer progression. Mol Cancer. 2022;21(1):74. Published 2022 Mar 12. doi:10.1186/s12943-022-01555-3

作   者：刘   浩

编   辑：姜小刚   马鹏炜

审   核：韩兴龙