【衡道丨笔记】「错配修复缺陷免疫组化解读」学习笔记

2022-04-09 17:54 衡道病理

种类多，分布广（1900万），个体内部保持一定的遗传稳定性(孟德尔共显性遗传)，因此，MS是重要的一类遗传标记，可以用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。在基因组中平均50kb就有一个重复序列。

微卫星不稳定（MSI）在结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等多个实体瘤中都是非常重要的分子生物标志物，并且具有多个临床意义。MSI 的发生与错配修复系统（MMR）功能异常密切相关。

衡道病理有幸邀请到江苏大学附属医院病理科的龙卫国教授，为大家带来《错配修复缺陷免疫组化解读》。为了方便大家更好地学习，我们已经在研习社上线了龙教授此次课程的内容，并针对此次龙教授的课程整理了配套的学习笔记。

微卫星的概念：

微卫星(microsatellite，MS)是DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，又称短串联重复(short tandem repeat，STR)，随机均匀分布于人类基因组的内含子、间隔区、外显子及调控区，核心序列为1～6 bp，重复次数15-60次，片段长度通常小于350 bp，目前认为其在维持基因组稳定和调控基因表达中发挥重要作用。

微卫星DNA序列的3种类型：

根据重复单元的构成与分布，微卫星ＤＮＡ序列被分为3种类型：

单一型:ATATATATATATATATATATATAT
复合型: ATATATCACACACACACACAC
间断型: ATATATCA ATATATCA ATATATA

微卫星（MS）的特点：

1：种类多，分布广（1900万），个体内部保持一定的遗传稳定性(孟德尔共显性遗传)，因此，MS是重要的一类遗传标记，可以用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。在基因组中平均50kb就有一个重复序列。

2：在个体之间存在高度的多态性，表现为正常人群的不同个体某一基因位点重复序列的重复次数可不一样。同一个体的两个同源染色体上重复次数也不一样。

尽管小、尽管简单又重复，但功能不可或缺，同时也容易出现问题!

位于编码区的MS易于出现复制滑脱(比一般编码区中其他基因的发生概率高10～100倍)，导致一个或几个重复的碱基插入或缺失，表现为MS的长度发生变化，进而产生微卫星不稳定（MSI）表型。

图1

图2

当编码区MS序列中涉及参与DNA修复(例如hMSH3、hMSH6)、DNA损伤反应(例如CHKl、MREllA)、细胞的凋亡(例如BAX、Caspase5)以及信号的转导(例如TGFpRII、IGF2R)的基因时，这些重要基因发生突变的概率变大，MSI表型就具有发展成肿瘤的潜能。

错配修复：

错配修复（MMR）基因的产物是错配修复蛋白，为一种核酸水解酶，通过在DNA 复制过程中修复错配的碱基使DNA 能精确复制，保证人类遗传的保守性和稳定性。当MMR 基因发生突变，错配修复蛋白的表达量下降、不表达或出现截短，对DNA 复制过程中发生的缺失和插入不能校正或纠错，引起基因组DNA 不稳定。

图3

图4

图5

MMR基因胚系/体细胞突变和MLH1基因启动子甲基化可以导致相应的MMR蛋白表达缺失或者无功能，进而引起DNA复制错误的累积-基因组的不稳定-肿瘤的发生。

基因组不稳定主要有两种途径：

1：DNA微卫星重复序列长度改变为特征的微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI) ，占15%。

2：整个或部分染色体变异为特征的染色体不稳定(chromo—some instability，CIN)：由于染色体局灶等位基因失衡、染色体扩增和易位等原因造成的，占85%。

表1

不同肿瘤其存在 dMMR/MSI-H 的比率

表2 不同肿瘤其存在 dMMR/MSI-H 的比率

MMR与Lynch综合征：

Lynch综合征占所有结直肠癌的2%-4%，是DNA的错配修复基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6最常发生）发生胚系突变的结果。可通过基因测序的方法来确诊。MMR基因突变相应修复功能蛋白缺失，导致DNA复制错误即MSI。

根据是否伴有肠外表现分两型：

1：Lynch Ⅰ型表现为家族聚集性结直肠癌。

2：Lynch Ⅱ型还伴有各种肠外器官恶性肿瘤，如子宫内膜、卵巢、胃、肺、肝胆、泌尿、皮肤、脑胶质细胞等。

Lynch综合征与MSI：

1：MMR基因的突变或修饰（甲基化）会导致MSI。

2：以结直肠癌为例：MSI途径结直肠癌占15%。

3：其中只有2%-4%是Lynch综合征相关，由MMR基因胚系突变引起，---突变表型

4：大部分约11%-13%的MSI型结直肠癌是散发性的，是由DNA的甲基化引起，---甲基化表型

5：并不是所有的MSI-H患者都是Lynch综合征，可能是由MLH1甲基化所致的MSI，进一步查BRAF V600E突变/MLH1启动子甲基化阳性的患者应排除Lynch综合征。

图6 Lynch综合征诊断标准的比较

（中华肿瘤杂志2018年1月第40卷第1期）

美国NCCN指南诊断标准：

改良Bethesda指南，其标准具体如下：

(1)确诊结直肠癌时年龄小于50岁；

(2)不论发病年龄，患有同时性或异时性的结直肠癌或其他林奇综合征相关肿瘤(子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等)；

(3)确诊结肠癌时年龄小于60岁且经组织学诊断为MSI-H表型(肿瘤浸润淋巴细胞、克罗恩病样淋巴反应、黏液细胞／印戒细胞分化、髓样生长模式)；

(4)确诊结直肠癌患者的一级亲属中至少1例确诊为林奇综合征相关的肿瘤且有1例肿瘤发生于50岁前；

(5)不论年龄，确诊结直肠癌患者的一级亲属或二级亲属中2例或2例以上确诊为林奇综合征相关的肿瘤。

图7 遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识（2018）

LS/MSI相关子宫内膜癌有如下常见的病理特征：

1：大多数组织学类型为I型内膜样腺癌，与普通内膜样癌类似，也可伴有黏液和鳞状分化，但Ls相关子宫内膜癌往往缺乏雌激素依赖关系。少数表现为Ⅱ型内膜癌，尤其是透明细胞癌和低分化癌，个别出现浆液性腺癌和癌肉瘤形态。

2：大多数I型内膜样腺癌镜下表现为肿瘤细胞巢周围出现显著的Crohn病样淋巴细胞浸润，肿瘤细胞之间也会出现许多淋巴细胞(>40／10 HPF)，并且肿瘤的异质性明显。

3：子宫下段是LS相关子宫内膜癌的好发部位。

4：Ls相关子宫内膜癌更易发生深肌层浸润，浸润深度往往与分化程度不一致，例如高分化内膜样癌伴有大于50％的肌层浸润。

图8

2020年中国卫生部结直肠癌规范化诊疗-辅助化疗

II期结直肠癌的高危因素：组织学分化差（III或Ⅳ级）且为pMMR或MSS、T4、血管淋巴管浸润、术前肠梗阻/肠穿孔、标本检出淋巴结不足12枚、神经侵犯、切缘阳性或无法判定。

MMR缺陷/MSI的筛查：

（1）MSI 的PCR检测：美国国家癌症研究所提出了一个５个标志物的套餐（ＢＡＴ２５，ＢＡＴ２６，Ｄ２Ｓ１２３，Ｄ５Ｓ３４６和Ｄ１７Ｓ２５０）作为ＭＳＩ的标准测试套餐。

（2）MMR蛋白IHC：MSH2-MSH6

MLH1-PMS2

如何解读PCR法检测MSI结果：

1：MSI-H（高微卫星不稳定）：大于或等于2个标记阳性

2：MSI-L（低微卫星不稳定）：只有1个标记阳性

3：MSS（微卫星稳定）：0个标记阳性

如何解读IHC法检测MMR蛋白：

1. 四种MMR蛋白：MLH1、PMS2、MSH2、MSH6

2. 阳性判读为细胞核棕黄色着色

3. 肿瘤核阳性着色大于5%表示蛋白质表达（正常）

4. 肿瘤细胞核完全失表达表示MMR蛋白缺失（异常）

5. 间质淋巴细胞和纤维细胞为阳性内对照

PCR法和IHC法优缺点：

图9 错配修复（MMR）蛋白家族的基本特征

MMR免疫组化结果解读简表：

总结：

1：LS是由DNA MMR基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）的胚系突变引起。

2：诊断LS需要分2步走：

第一步：PCR或IHC初筛
第二步：基因测序确定突变基因

影响IHC检测MMR蛋白的因素：

1. 标本前期处理

2. 免疫组化试剂

3. 结果判读的主观性

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肿瘤,直肠癌,内膜,微卫星,重复

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