研发思路参考：新型PCR方法在POCT领域的应用

    目前我们知道一些新型PCR方法已经被构建用来实施快速扩增。

由GNA Biosolutions GmbH（德国马丁斯里德）开发的激光PCR是根据核酸在功能化纳米粒子上的脉冲控制扩增（PCA）的原理进行的。

—— 激光激活的PCA在局部引发了瞬时的加热和冷却，而反应的大部分则保持在一个恒定的温度。鉴于激光波长和金纳米粒子的质子吸收特性相匹配，激光照射胶体纳米粒子（最好是由金制成的）能够对均匀分散的纳米粒子进行局部和超快速的加热。激光以短脉冲（如微秒）加热纳米粒子（皮摩尔浓度），从而在核酸扩增过程中保持批量反应温度基本不变。通过有效地将热循环限制在纳米粒子上，引物附着在纳米粒子的表面，激光PCR可以实现加热和冷却循环，可以在10分钟内对10拷贝的目标核酸完成扩增[24]。

Katharina Müller等人进一步开发了一种更加经济的脉冲控制扩增方法。

—— 利用能量脉冲控制直接嵌入扩增反应中的微尺度金属加热元件，在几微秒内加热反应体积的一部分。被加热的微循环器几乎瞬间冷却，形成了超快的加热和冷却循环，只需15分钟就可以完成典型的扩增反应[25]。

  除了这两种基于时间改变的快速扩增技术，另一类则是基于空间改变实现的。  

Katharina Müller等人报道了一种在Rayleigh-Benard对流腔内进行的PCR方法。

——利用在特定尺寸的对流腔的两端施加的恒定温度（变性和退火的典型温度值），形成腔内反应液的在重力方向上的温度梯度，进而导致其密度梯度的形成以引发自然对流。反应液的对流运动在温度区域间进行，偶联的DNA变性和退火随之进行[26]。

Wen Pin Chou等报道了利用对流PCR技术在30分钟内完成3种病毒基因组扩增的研究，检测限达到了30拷贝/反应[27]。

——对流PCR技术采用简易温控设备（单个或多个空间分布的恒温热源）进行快速PCR的方案，但由于驱动力是自然对流，目前还没有实现对反应进展的有效预测和控制，因而难以进行定量检测。

另一类基于空间改变的快速PCR方案驱动样本在一种微通道内移动，该通道被放置在相关加热块的顶部表面，在整个反应过程，各加热块保持恒温[28]。

——这类流动式的PCR设备根据反应液流动的方向可以分成两种形式，朝一个固定方向持续流动的被称为连续流PCR，另一种反应液被驱动在两个加热块之间返复流动，可被称为“返复流PCR”。

  除此之外，焦磷酸盐沉淀引发浊度改变已被用于LAMP反应的视觉终点检测。 [23] 加入钙黄素染料可以通过荧光增强浊度。为了获得不同颜色的沉淀物，可添加阳离子聚合物以及荧光标记的引物和探针 [29] 。这些方法都可在反应管密闭状态下完成检测，因此可将扩增子污染的风险降至最低。此外，等温扩增和基于微阵列检出装置组合，用于多重靶点的检测 [30] 。新型的流体管理和分腔设置使得小规模的多靶点检测变得更加方便。   光学检测一直是Real-Time PCR的主流方案。 led光源已经大部分替代了原来笨重、昂贵且容易损坏的卤素灯，光电二极管（PD）也正在越来越多的被应用于检测偶联PCR反应过程中被水解的Taqman探针发出的微弱光信号。然而由于分光的需要，检测光路所需的各种光学元件使得检测系统的微型化变的困难。电化学生物传感器已经被证明可以小型化并集成到微流控设备中。 

  实际上，IVD制造商将分子诊断推向POCT环境所作的努力，促进了样本制备（核酸提取纯化）、扩增和检测等技术的发展和集成。 功能集成对于分子诊断主流技术PCR在复杂性和污染风险控制等核心问题的解决是至关重要的。 PCR实验室一贯强调合理的分区和必要的人员训练水平，旨在通过制度安排降低这些问题带来的风险，但同时也造成了实施分子诊断的条件障碍。制造商必须证明其系统进行了周密设计以控制这些风险。 精心选择和开发合适的关键技术的组合方式，并以更稳健、用户友好的形式提供产品仍是一个挑战。 简便高效的核酸提取技术、轻量化的快速扩增和检测方法的发展为新一代的集成方案提供了更多机会。进一步的以更经济的方式提供分子POCT系统可以使得基层医疗和资源匮乏地区的医疗机构成为市场。lucira 公司将LAMP和一种新型的光学检测装置组合提供了“非仪器”的一次性分子检测产品，并通过FDA EUA进入家庭自测场景，首次将分子检测的应用拓展到家用是一个振奋人心的事件。专业市场和自测市场具有迥异的需求关注，各种独特的技术组合可以通过各自方式进入市场。此外，为宠物医疗、食品安全、环境监测和兽医检测等非临床应用开发的系统与临床应用一样需要更简便、更快速等类似的特性，但更容易进入市场，并为临床分子POCT奠定基础。

【参考文献】

[23] Mori, Y. and Notomi, T. (2009) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J. Infect. Chemother. 15, 62–69.

[24] Lars Ullerich, Stephanie Campbell, Frank Krieg-Schneider, Federico Bürsgens and Joachim Stehr.Ultra-fast PCR technologies for point-of-care testing. LaboratoriumsMedizin Volume 41 Issue 5.

[25] Katharina Müller. Pulse-Controlled Amplification–A new powerful tool for on-site diagnostics under resource limited conditions. PLoS Negl Trop Dis. 2021 Jan; 15(1): e0009114.

[26] Krishnan, M. (2002). PCR in a Rayleigh-Benard Convection Cell. Science, 298(5594), 793–793.

[27] Wen Pin Chou, Ping Hei Chen, Jr Ming Miao, Long Sheng Kuo, Shiou Hwei Yeh & Pei Jer Chen. Rapid DNA amplification in a capillary tube by natural convection with a single isothermal heater. BIOTECHNIQUESVOL. 50, NO. 1.

[28] Madhusudan, Kulkarni and Sanket Goel. Advances in continuous-flow based microfluidic PCR devices—a review. Eng. Res. Express 2 042001.

[29] Mori, Y. et al. (2006) Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers. BMC Biotechnol. 6, 3.

[30] Andresen, D. et al. (2009) Helicase dependent OnChip-amplification and its use in multiplex pathogen detection. Clin. Chim. Acta 403, 244–248.