精准前沿丨胰腺癌亚肿瘤微环境的空间限制

本期《精准前沿》栏目分享加拿大多伦多大学Rama Khokha研究团队发表于Cell（IF =41.582）上的一篇研究[1]，研究利用多组学联合组织学解读人类胰腺癌肿瘤微环境，通过肿瘤内异质性解读“肿瘤微环境如何推动恶性肿瘤进展”这一前沿问题。该研究发现并定义了“亚TME”概念，其与肿瘤免疫、亚型、肿瘤分化以及治疗密切相关。该研究发现亚TME起源于成纤维细胞的分化轨迹。此外，还发现胰腺TME内强异质性不是随机的，而是基本组织单位的标志。

研究背景

肿瘤微环境（TME, tumor microenvironment）对肿瘤的发生、进展以及治疗效果具有重要作用，而肿瘤内的异质性是理解TME如何推动肿瘤恶性进展的关键。胰腺导管癌（PDAC）的临床相关亚型中，细胞外基质（ECM）丰富/促结缔组织增生细胞的转录特征与较差的预后有关。然而，基于组织的研究表明，富含胶原蛋白和 ECM 的基质可产生更好的预后。同样，尽管大量功能研究表明CAF（成纤维细胞）可以促进PDAC进展和化学耐药性，但同时大量研究表明基质含量越高，预后越好，并且CAF的消耗可导致小鼠中更具侵袭性的肿瘤。肿瘤/TME相互作用并不是统一地促进或抑制肿瘤，错综复杂的研究结果让其身份扑朔迷离。

研究设计

样本设计：

143例术后胰腺癌病理（切片n=210）和159例TCGA胰腺导管腺癌数据库的病理结果。

研究设计：

一、组织病理表型与临床结局

（1）组织病理切片鉴定亚TME。（2）不同亚TME组合的预后差异。

二、亚TME组合和功能研究。

（1）多组学揭示亚TME的分子景观。（2）组织微阵列、病理、免疫组化，解析细胞组成。（3）单细胞测序揭示CAF功能，推断亚TME分化轨迹。

三、多层面揭示亚TME对肿瘤进展和治疗的影响。

（1）细胞、类器官研究亚TME对肿瘤恶性进展的影响。（2）药敏实验揭示其对化疗抵抗的作用。

四、预测模型建立

（1）随机森林建模。（2）模型评分进行临床预后。

研究结果

1. 人类PDAC中广泛存在的亚TME与预后较差有关

通过组织病理切片，以细胞与非细胞组分比例、细胞外基质（ECM）的成熟度和范围以及间质细胞形态三个特征为标准，将TME分为以下三种可重复的亚TME表型：（1）“荒漠型（deserted）”区域；(2) “反应型（reactive）”区域；（3）介于两者之间的中间过渡型（intermediate）（图1A-D）。对143例术后胰腺癌病理切片和159例TCGA胰腺导管腺癌数据库的病理切片进行筛选，发现多种亚TMEs表型共存并且占有很高比例（分别占53%和70%）（图1E-H）。生存分析显示，单纯以一种主要的TME分组无法区分患者的生存差异（图1J）；但是以单一亚TME和多种亚TMEs共存分组结果显示，多种亚TMEs组具有更差预后。这个现象说明了亚TME的分布形式对肿瘤性质及预后具有重要影响（图1K）。

图1. 亚TME与预后密切相关

2. 亚TME分子景观在ECM、CAF激活和免疫特征的差异

从32个未经治疗的患者中，通过激光捕获显微切割（LCM），分别提取不同的亚TME以及驻留在其中的肿瘤细胞。将样品通过鸟枪蛋白质组学和RNA测序（RNA-seq）进行平行分析（图2A）。MultiOMIC分析鉴定了5708个独特的蛋白质组和17945个转录本（图2B-C）。进一步研究发现，荒漠型亚TME与中间型/反应型亚TME的1194个蛋白组基因和358个转录组基因存在差异表达，其中包括已知的肿瘤/间质互作相关基因（FBLN5、IGFBPs），以及CAF亚群标记分子（ENG、LRRC15、DES、Thbs4）。基因富集分析发现荒漠型亚TME表现出明显的ECM信号和体液免疫通路的富集。中间型/反应型亚TME显示出细胞应激反应、CAF激活和调节免疫功能的生长因子、细胞因子以及细胞免疫相关通路的显著激活（图2H-J）。

图2. 亚TME分子景观在ECM、CAF激活和免疫特征差异

3. 反应型亚TME具有抗肿瘤免疫特性的基质细胞群

在PDAC切除术（n = 143）的组织微阵列中，首先通过组织病理学确定了每个核心的亚TME（n = 596），然后应用25个marker的免疫组化结果进行数字定量。构建胰腺癌组织的深层表型平台（图3A）。结果显示反应型/中间型亚TME的T细胞（CD3）、巨噬细胞（CD68）、内皮细胞（CD31）和CAFs（aSMA）标志物染色增加，而荒漠型亚TME显示更多更成熟的胶原，并倾向于更高的B细胞标记（CD20）表达，说明了肿瘤内不同亚TME间具有特异性免疫环境（图3B）。这种模式既可以在全球范围内的患者中看到，并且在在患者配对的反应性/荒漠区域（图3C）和边缘反应性/荒漠区域（图3D）中都可以看到。进一步对间质标记物的相关性分析显示，荒漠型亚TME具有小而分散的免疫细胞簇。而反应型亚TME呈现一个聚集性的簇（图3E-F）。反应型亚TME中CD8+ T细胞总数增加，增加了CD8+细胞和CD3+细胞直接接触肿瘤细胞。患者匹配的肿瘤细胞全基因组测序图谱（n=104）显示，在反应型亚TME为主的肿瘤中，SNV和新抗原计数较高。这表明反应型亚TME中存在局部T细胞炎症免疫表型。此外，反应区IDO-1水平更高，PD-L1水平有增加的趋势，包括FOXP3（调节性T细胞）、CD11b和CD15（通常在MDSCs中表达）和CD206（M2巨噬细胞）在内的抑制性免疫细胞类型也增加了（图3G-K）。

图3. 反应型亚TME具有抗肿瘤免疫特性的基质细胞群

4. PDAC亚TME中的CAF群落建立了具有不同行为和功能的协调表型

多组学差异分析显示出CAF对于亚TME的显著差异（图4A-B），研究人员从13个新鲜PDAC标本中提取CAF，这些标本具有组织病理学证实的亚TME（图4C），用于单细胞和功能表征。CAF单层的生长模式与其起源亚TME的特征组织学密切相关（图4D）。进行细胞培养和功能鉴定，发现反应型亚TME CAF侵袭性更高，而荒漠型亚TME CAF生长更快（图4E-F）。对体外培养的10个亚TME进行单细胞测序。非监督聚类并进行亚TME分组和功能注释（图4I-J）。结果显示荒漠型与生长相关，这与对应的CAF生长更快的结果一致。反应型亚TME来源的CAF则显示出更广泛的功能分子特性：炎症相关和EMT基因集在反应性亚型簇中富集，这表明组织中的反应型亚TME的显著炎症特征，可能是CAF引起的，并且其侵袭性增加。进一步通过CytoTRACE推断CAF分化轨迹，预测了从荒漠型（分化较低）到反应型（分化较高）的分化轨迹。多能标志物（NT5E、ENO1、ITGB1、CD44、LGALS1、KIT）持续下降，而CAF激活标志物（FAPA、ACTA2/ASMA、S100A4）、调节因子（NNMT）和炎症表型标志物（IL-6、IL-1B）持续上升。以上结果说明，亚TMEs的形成源于具有协调的表型、行为和功能的复杂CAF群落的总体分化状态（图4M）。

图4. PDAC亚TME中的CAF群落建立了具有不同行为和功能的协调表型

5. 反应型亚TME促进了增殖性、基底样和低分化的肿瘤细胞表型

为了研究亚TME与PDAC恶性行为之间的关系，比较了反应型与荒漠型亚TME的肿瘤上皮的多组学表达谱。反应型亚TME的肿瘤在细胞周期进展（G2M期、E2F靶点）、致癌信号（MYC）和干扰素反应方面富集，而荒漠型来源的肿瘤则在细胞代谢（脂肪酸、OxPhos）、蛋白质分泌和药物代谢方面富集（图5A-B）。通过类器官与不同亚TME的CAF共培养，结果显示反应型亚TME内的肿瘤细胞表现出更高的增殖指数（图5C-E）。同时反应型亚TME的肿瘤细胞鳞状标记物CK5高表达，分化因子GATA6低表达，表现出更多的基底样表型（图5F-G）。肿瘤内的反应性和荒漠的亚TME通常伴随着肿瘤表型的区域变化（图5I）;相应地，肿瘤分化与显性TME表型相关（图5J）。因此，在具有一种主要TME状态的早期可切除肿瘤中，反应性显性TME趋向于缩短无病生存期（图5K）。总之，荒漠型亚TME倾向于支持肿瘤分化，而反应型亚TME通过增殖、去分化、鳞状/基底样瘤细胞表型促进肿瘤进展。

图5. 反应型亚TME促进了增殖性、基底样和低分化的肿瘤细胞表型

6. 荒漠型亚TME会导致化疗抵抗

鉴于基质对PDAC治疗的影响，研究人员探究了亚TMEs对化疗抵抗的影响。结果显示荒漠型PDAC的PDOs（patient-derived organoids）显示出吉西他滨耐药性（图6A）。此外，在COMPASS试验的患者中，荒漠型显性TME与1期间反应不佳（图6B）以及最小平均肿瘤大小变化（图6C）密切相关。荒漠显性TME与预后不良相关（图6F）。进一步探寻化疗是否会影响TME状态。与初治病例相比，接受新辅助治疗的PDAC(n=40)更多地表现出以荒漠型为主的TME（图6G）。虽然新辅助治疗病例仍然表现出多个亚TME，其频率与未治疗切除（图1H和1I）相似，但它们几乎完全由荒漠和中间型亚TME组成。同时IL-6和FAPα的基质免疫反应性显示出降低的现象（图6H），代表着荒漠型的CAF表型。在15对患者配对的治疗前/后活检中，观察到9/15例从反应/中间型为主转变为荒漠型为主，1/15例反应型转变为中间型；4/15分别保持废弃或中间型。总的来说，在化疗后，荒漠型亚TME增多，并会导致化疗抵抗（图6I）。

图6. 荒漠型亚TME会导致化疗抵抗

7. Bulk RNA水平建模预测基质亚TME并证实基质异质性的预后影响

最后，研究人员利用亚TME特异性表达模式从公共bulk RNA-seq中推断TME表型和异质性（图7A）。使用随机森林建立“TMEPHENOtyper”模型，虚拟肿瘤含量为48%时，模型准确率达到95.7%（图7B）。将模型应用于TCGA PAAD数据集中的177个组织RNA-seq中（图7C）。与低基质含量相比，高基质含量样品中预测效果略好（在>50%基质下表现为93.4%，而在<50%基质时为84.2%;图 7D）。最后，通过使用亚TME评分作为TME异质性和TME状态的指标来测试TME PHENOtyper是否可以识别预后患者亚组（图7E）。结果显示高的亚TME评分（反应型或荒漠型前25%的评分）具有更好的预后。当使用前12.5%的分位数时，预后效果更好，这表明TME异质性的增加与患者预后较差持续相关（图7F）。

图7. 亚TME评分证实基质异质性的预后影响

讨论

本研究通过整合大规模组织学、多组学数据，以及临床数据，来解读人类胰腺肿瘤微环境（TME）。发现并定义了"亚TME"，即以成纤维细胞可塑性为基础的、在组织学上可定义的组织状态，与肿瘤免疫、亚型、分化和治疗反应有区域关系。"反应型"亚TME富含复杂但功能协调的成纤维细胞群表现出热免疫状态，并由侵略性的肿瘤细胞表型驻扎。富含基质的"荒漠型"亚TME包含较少的活化成纤维细胞，表现出肿瘤抑制特征，但具有明显的化疗抵抗特征。亚TME起源于成纤维细胞的分化轨迹，在单细胞转录组学和原位都有明显的过渡性状态。亚TME评分可以反应TME异质性，可用于临床预后。

结语

本研究首次揭示肿瘤微环境中不同区域、不同表型的亚微环境类型，借助LCM精准提取不同亚TMEs类型，进行多组学分析，证实了肿瘤内亚TMEs组成和功能异质性对肿瘤性质以及患者生存的影响。总结为：（1） PDAC区域异质性源于亚TMEs；（2） 亚TMEs表现出不同的免疫表型和CAF分化状态；（3） 亚TMEs执行不同功能：肿瘤增值生长和化疗抵抗；（4） 肿瘤内亚型共存与基质异质性相关并能代表患者预后。 

END 

参考文献：

[1] Grünwald BT, Devisme A, Andrieux G, et al. Spatially confined sub-tumor microenvironments in pancreatic cancer. Cell. 2021; 184(22):5577-5592.e18.  doi:10.1016/j.cell.2021.09.022

撰写丨 lilu

编辑、排版丨SX

审校丨Lesley