分子诊断<新技术>在遗传性疾病诊断的应用

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（图片来源：摄图网）

遗传性疾病是指由生殖细胞遗传物质的改变而引发的疾病，包括染色体病、基因组病、单基因病、线粒体基因病和多基因病等。由于遗传性疾病病种繁多，临床表现复杂多样，且多为罕见病，临床上极易发生漏诊、误诊。

自PCR后时代开始，遗传病的分子诊断不断获得突破性进展。本文基于分子诊断技术在遗传病诊治的应用现状，重点介绍分子诊断新技术的发展趋势和应用前景，分析各技术应用于不同类型遗传病诊断的优缺点，以期帮助临床更好地认识分子诊断技术，从而合理应用于遗传性疾病的诊断。 

（ 作者：张仪 王剑  单位：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心）

01

数字PCR （digtal PCR, dPCR）

定义

dPCR是一种可对目标DNA模板绝对定量的新一代PCR技术，通过有限稀释待测核酸溶液并分配到不同反应单元，使每个反应单元的核酸模板数少于或等于1个，经过特异性探针扩增，检测各反应单元的荧光信号，依据泊松分布原理及阳性反应单元数目获得靶分子的起始拷贝数。

分类

按照分液方式可分为微流体数字PCR、微滴数字PCR和芯片数字PCR。

优点 ★

dPCR可富集待测序样本中的靶基因，检测基因组拷贝数变异、甲基化含量、基因表达绝对定量，具有灵敏度高、样本需求量少等优势。

缺点

但dPCR也存在成本高、操作繁琐、通量有限等不足，相信随着技术优化、自动化程度提高，其技术优势可得到进一步挖掘。

应用

无创产前诊断、遗传病诊断

02

二代测序 （next-generation sequencing, NGS）

定义

NGS又称高通量测序，是一种大规模平行测序技术，可同时测定几十万至几百万条DNA分子。

分类

根据检测范围不同，NGS可分为全基因组测序、全外显子组测序和靶向基因组测序。

优点 ★

靶向基因组测序多针对经评估明确致病的基因，测序深度较高、成本较低；全外显子组测序和全基因组测序则可能发现新的致病基因，后者还可以检测到非编码区变异，通量大、数据丰富。

缺点

但NGS读长短（仅约150bp），无法准确检测三核苷酸重复所致疾病如脆性X综合征；无法区分同源性高的假基因；无法准确检测小范围拷贝数变异如微缺失、微重复等。

应用

  随着测序成本降低、生物信息学的快速发展，遗传病的临床诊断愈来愈得益于对测序结果的精确解读。目前NGS已经成为遗传病基因诊断的主要方法，可检测单个碱基到几个碱基突变，亦可检测基因组拷贝数变异。

03

第三代测序

定义

第三代测序技术的特征在于单分子测序，无需PCR扩增即对单个DNA分子进行测序。

分类

按原理不同可分为单分子实时测序技术（single-molecule real-time sequencing technology, SMRT）和纳米孔测序技术。SMRT技术在每个零模波导孔中，以待测DNA分子为模板，在DNA聚合酶催化下按照碱基互补配对原则，带有不同荧光标记的dNTP进入孔中参与合成，通过检测荧光信号，以达到边合成边测序的目的。纳米孔测序技术则检测待测DNA链以单个核苷酸的步长通过纳米孔时相应的堵孔信号，以获得DNA序列信息。

优点 ★

第三代测序技术具有超长读长，相对于NGS克服了很多不足，SMRT平均读长可达约10 kb，纳米孔测序技术则可达5 kb；因无需扩增可有效避免扩增引入的系统偏向性。

缺点

目前第三代测序技术仍存在错误率较高的问题，其中SMRT可达约15 %，即便可通过多次重复克服随机性误差，仍限制了其在临床诊断中的应用。随着技术进步，第三代测序技术将向长度长、低错误率发展，以更适用于遗传病的临床诊断。

应用

  可用于检测高度杂合基因组以及大的结构变异等。第三代测序技术在遗传病诊断中已有应用，Merker等人通过该技术检测到PRKAR1A基因结构变异，从而诊断1例Carney综合征患者。

04

多重连接探针扩增技术 （multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）

定义

MLPA是一种中通量的可同时检测多个DNA序列的定性和相对定量的分子诊断技术。该技术针对基因组靶区域设计多对杂交探针，经复性杂交连接，通过通用引物同时扩增多个基因组靶区域，以扩增信号的强度反应基因组靶区域的拷贝数。

优点 ★

成本较低、灵敏度高、特异性强、操作简便。

缺点

无法检测低水平嵌合和染色体平衡易位，不适合检测未知的点突变类型等局限。

应用

  可检测基因组中的微缺失和微重复以及DNA甲基化水平，临床上多用于诊断由基因组缺失/重复或由表观遗传异常所导致的遗传性疾病，如脊髓性肌萎缩症、假性肥大型肌营养不良、Prader-Willi/Angelman综合征等，在产前诊断方面也有着很大的应用价值。

05

微流控芯片

定义

微流控芯片，又称芯片实验室（lab-on-a-chip），指在微纳米尺度空间操控流体进行实验的技术。通过微加工工艺得到流体通道、反应腔室等微结构单元，操控流体配合仪器完成实验室检测各步骤。

优点 ★

样本需求量少、检测覆盖率高，利于早期筛查和诊断，可为无创产前诊断提供新的技术支持。

缺点

研发周期长、生产过程较为复杂、对专业技术要求高，尚待降低生产成本以推广其在遗传病诊断中的应用。

应用

  Yang等人研发了基于流体力学分离和免疫识别的胎儿细胞捕获芯片，可高效富集胎儿细胞，在孕早期实现胎儿细胞的有效分离，并可通过Y染色体基因特异性分析，确认胎儿细胞来源。日前，用于遗传性耳聋相关基因检测的微流控芯片法试剂盒业已通过国家药品监督管理局批准，该方法联合竞争性等位基因特异性扩增技术，检测常见耳聋基因的23种突变，可帮助临床筛查遗传性耳聋患者。

06

单分子光学图谱技术

定义

单分子光学图谱技术可经内切酶原位切割DNA分子并标记荧光，获得限制性内切酶酶切位点分布图，有利于分析高复杂区重复序列和基因组结构变异。结合NGS能够克服其读长短的缺陷，帮助精确组装基因组。

优点 ★

可检测kb级别的平衡变异，灵敏度高；

缺点

无法检测微小片段插入或缺失，且样本处理、检测流程和数据分析尚待进一步优化。

应用

  美国BioNano公司开发的光学图谱平台在临床诊断中的有效性已得到验证，可成功鉴定杜氏肌营养不良症和肩肱肌营养不良症的各种结构变异。

07

RNA测序 （RNA-seq）

定义

RNA-seq即采用NGS技术对转录组进行测序，可检测编码区或非编码区变异对基因表达水平及选择性剪接的影响。

优点 ★

可完成双组学或多组学分析，还可避免遗漏假外显子相关的深度内含子突变，帮助提高诊断率和致病性证据等级。

缺点

RNA-seq受到基因在不同组织细胞表达特异性的影响，在选择检测材料上易受限制，并且逆转录过程可能出现错误，对大量数据的高效分析也是一项挑战，这些局限性对其在临床上普遍推广带来了困难。

应用

  2017年Cumming等人通过RNA-seq诊断遗传性肌肉疾病，检出率高达35%，并且显示了RNA-seq在剪接位点变异的检测中相较于全基因组测序和全外显子组测序的巨大优势，首次证明了RNA-seq在遗传病诊断中的重要意义。Starokadomskyy等人应用全基因组测序结合RNA-seq诊断出导致X连锁网状色素异常的POLA1基因突变，同时也揭示了该基因导致疾病的机理。     近期张锋等人基于RNA-seq结合CRISPR-Cas9开发出在体Perturb-seq技术，应用于自闭症谱系障碍和神经发育迟缓风险基因的研究。利用该技术在细胞类型复杂多样的神经组织中，可从单细胞水平揭示不同风险基因不同突变位点对各种细胞各阶段状态的影响，该技术在将来可用于多种疾病和组织，对于神经系统相关疾病以及多基因病的诊断和机制研究提供了一种体内大规模系统遗传研究的有效工具。

08

核酸质谱

定义

核酸质谱技术主要是依托基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）与分子生物学技术相结合进行检测。MALDI-TOF MS可对离子化的待测样品通过脉冲电场加速，经测定不同分子量的离子以各自的恒定速度飞向离子检测器所需飞行时间，并经换算以区分不同分子量的物质。

优点 ★

通量高、准确度高、灵活性高、检测成本低、周期短，是一种性价比高的中等通量检测技术，在遗传病筛查和出生缺陷防控上有着广阔的应用前景，目前在遗传性耳聋和地中海贫血等疾病的诊断筛查中已得到运用。

缺点

对样本处理要求高，易受PCR污染影响，在图谱采集和数据分析等方面尚无统一标准，可能影响室内和室间重复性。相信随着技术的进步、规范和推广，核酸质谱凭借自身特色将跻身遗传病分子诊断技术前列。

应用

①基因突变检测，主要基于PCR和单碱基延伸技术；     

②DNA甲基化水平检测：主要通过将甲基化和未甲基化的C碱基比例转换为分子量相差16 Da的G碱基与A碱基之间的比例，来估算片段平均甲基化水平；     

③拷贝数变异检测：通过单核苷酸多态性等位基因比例来对靶基因进行定量分析；     

④核酸质谱对NGS结果验证的灵敏度高于Sanger测序，尤其对于比例低于15 %的突变，当NGS和Sanger测序结果不一致时可通过核酸质谱进一步验证。    

小结与展望

遗传病的治疗方案相对有限，多为对症治疗，对发病机制了解得越透彻全面，越有利于治疗药物的研发。而分子诊断技术的灵活应用可以在遗传病发病机制和治疗方法研究中发挥重要作用，尤其是多组学研究有助于进一步认识基因突变对机体、组织、细胞的分子水平的影响。并且随着生物信息学的发展，大数据分析技术不断优化和进步，愈来愈多的有效信息将被挖掘和利用。相信随着分子诊断学技术的发展，人们对遗传病的认知将愈加深刻，在诊断和治疗上也将更加全面、深入和成熟。

-End-