快报｜应用全基因组测序技术调查岛上人群10年间肺结核流行与传播的研究

近日，《微生物学前沿》（Frontiers in Microbiology）杂志在线发表了上海市疾病预防控制中心的一项应用全基因组测序技术调查岛上人群10年间肺结核流行与传播的研究（A Whole-Genome Sequencing-Based Study to Delineate the Risk and Characteristics of Tuberculosis Transmission in an Insular Population Over 10 Years in Shanghai. Front Microbiol. 2022;12:768659.）。研究结果显示，卫生机构诊断延迟和异烟肼耐药是该地区肺结核传播的关键危险因素。上海市疾病预防控制中心汪敏和张阳奕为论文共同第一作者，潘启超主任和江渊副主任医师为论文共同通讯作者。

结核病是一种慢性传染病，在全球范围内仍然是严重的公共威胁。结核病的发病和传播机制比较复杂，新发结核病可能是近期传播或者是内源性复燃导致的，明确一个地区结核病的发病模式有利于制定有效的防控措施。崇明岛是中国第三大岛，地处上海郊区，位于长江入海口，地理位置独特，外来人口少，人口流动性较低。虽然已采取多项防控措施，但是结核病的发病率下降较为缓慢。全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）在结核病分子流行病学研究中发挥着越来越重要的作用，极大地促进了我们对这一古老疾病的理解。目前，高通量的全基因组测序技术主要应用于区分结核病的内源性复燃和外源性再感染、鉴定传播、衡量宿主内多样性、识别原发性和获得性耐药。本研究以上海市崇明区为研究现场，对上海市疾病预防控制中心收集到的该地区2009—2018年所有肺结核患者结核分枝杆菌临床分离株进行全基因组测序，分析与传播有关的危险因素，描述崇明区这一人群相对稳定、外来人口较少的岛上结核病传播的风险和特征。

1. 样本来源：2009年1月至2018年12月上海市崇明区菌阳肺结核患者525例，上海市疾病预防控制中心收集并保存其中370例（70.48%）患者临床菌株。排除样本核酸提取失败、样本污染、复发患者菌株后，研究最终纳入345例该地区菌阳肺结核患者及菌株进行后续分子流行病学和现场流行病学研究分析。

2. 全基因组测序：纳入样本在经过复苏、灭活、基因组DNA提取、DNA定量、文库构建和质量控制后，在illumina HiSeq 2500测序平台进行读长为双端150 bp的测序，每个样本测序深度≥100×。

3. 全基因组测序数据分析：测序下机数据经Fastp软件处理后，应用Fastqc进行质量评估。以结核分枝杆菌H37Rv标准株（NC_000962.3）的全基因组序列作为参考序列进行测序数据比对。以突变频率高于75%，出现频数5次及以上为标准，鉴定出各个样本中的固定突变。使用MEGA X软件基于最大似然法和bootstrap值为500构建崇明地区结核分枝杆菌系统发育树，根据每个菌株在系统发生树的位置和关键单核苷酸多态性（SNP）鉴定每株菌株的家族谱系和亚型。应用脚本根据上述的合并SNP文件计算每株菌株两两之间的SNP距离，根据前期研究以12个SNP差异为阈值，鉴定成簇菌株。

4. 一线抗结核药物耐药表型检测：按照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》进行，采用比例法进行4种一线抗结核药物敏感性试验。含药L-J培养基中抗结核药物的终浓度为：利福平40.0 µg/ml、异烟肼0.2 µg/ml、链霉素4.0 µg/ml、乙胺丁醇2.0 µg/ml。

5. 流行病学调查及传播网络分析：从上海市肺结核专报系统收集获得患者的人口学信息、临床特征、实验室检测结果等资料。对遗传距离≤12个SNPs的成簇病例进行流行病学调查，在获得知情同意后，我们进行了现场访谈或电话访谈的流行病学问卷调查。为识别成簇病例间的流行病学联系，我们收集了有关密切接触者、社会接触者、确诊结核病前常去的地方，包括病历、工作单位、住址等信息。

6. 统计学分析：利用统计软件SAS 9.3对数据进行整理和分析，分类资料的组间比较利用卡方检验，当期望值小于5时，使用Fisher精确概率法。对于正态分布的连续性变量（如年龄)，使用t检验比较，方差不齐的两样本均数的比较，采用秩和检验。采用多因素Logistic回归分析，分析应变量是否成簇与患者的社会人口学特征，基因分型，临床特征等因素之间的关系，检验水准为α=0.05。

1. 根据全基因组测序结果绘制2009—2018年上海市354株结核分枝杆菌临床分离株的系统进化树（图1）。紫色三角形代表9例复发患者分离株。去除9株复发患者菌株后，345株临床菌株基因分型结果：lineage 2占绝大多数（n=298，86.38%），其次分别是lineage 4（n=46，13.33%）和lineage 3（n=1，0.29%）。其中Sub-lineage 2.2.1为主要的基因亚型（n=289，83.76%）。粉红色五角星代表成簇菌株，遗传距离≤12个SNPs。外环显示的是患者的户籍信息，绿色代表本地居民，橙色代表非本地居民。从内到外，立体的彩色圆圈分别代表异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸和利奈唑胺等药物相关的耐药基因突变信息。

2. 菌株聚类分析：345株结核分枝杆菌临床菌株中成簇菌株94株，按照n法计算，成簇率为27.25%（94/345）。成簇菌株形成了由2～5个病例组成的42个基因组簇，其中以2个病例组成的簇最多（74.47%，70/94）。

3. 成簇相关因素的单因素与多因素分析：通过比较成簇患者感染菌株的病原学特征、患者病史资料等因素的差异，研究发现成簇患者感染北京基因型菌株、出现异烟肼耐药和任意耐药，以及患者确诊延误≥14天的比例均高于非成簇患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。依据既往研究和单因素分析的结果，通过多因素分析校正混杂因素年龄、职业以及基因型，探索确诊延误、户籍以及菌株耐药性等因素与肺结核患者成簇之间的关系。多因素Logistic回归分析结果显示：年龄、确诊延误、基因型以及户籍是影响成簇的危险因素。年龄越小，成簇的风险越大，年龄＜65岁的患者成簇的风险是≥65岁患者的3.11倍（95%CI：1.76～5.49），确诊延误≥14天的成簇风险是确诊延误＜14天的2.57倍（95%CI：1.34～4.95），北京型菌株比非北京型菌株更容易传播（AOR=3.35，95%CI：1.32～8.53），与外地病例相比，本地病例传播肺结核的风险更高（AOR=2.43，95%CI：1.18～4.99），菌株发生异烟肼耐药的患者成簇的风险是非异烟肼耐药的2.36倍（95%CI：1.15～4.88）。

4. 流行病学调查和传播网络分析：成簇病例共有94例，排除已死亡、拒绝配合、电话变更等合计61例失访的患者后，最终对33例成簇病例完成了流行病学调查，应答率为35.11%（33/94），涵盖了52.38%（22/42）的簇。调查发现：在42个基因组簇中，有4个簇存在确定的流行病学关联；根据居住地址，我们发现同一个簇的几例患者居住在同一乡镇，推断出有12个簇28例患者存在可能的流行病学关联；8个簇无流行病学关联；18个基因组簇中的病例全部失访，因此无法判断是否存在流行病学关联。有几个簇的患者有家庭成员或同学的结核病暴露史；有4个簇患者诊断为肺结核病例前在崇明岛外工作过，但是全基因组测序数据表明其与崇明岛本地居民感染的菌株为同一簇菌株。本研究也发现，同一簇内的不少患者存在性别相同、职业相同和年龄相近的情况，学生等青年人常去学校、网吧、酒吧等场所，老年人最常去的是菜市场（农贸市场）、超市、社区活动中心、棋牌室等。这从侧面反映了同类人群之间可能会存在偶然接触传播，这些可能与当地不同年龄段居民的生活方式及乡镇分布状况有关。

本研究通过对2009—2018年上海市崇明区新登记肺结核患者的基因组流行病学研究，系统地描述了上海市崇明区结核病传播特征和结核病传播的主要危险因素。全基因组测序技术能够准确识别成簇菌株，传统流行病学能够进一步验证成簇之间是否存在确定的或可能的流行病学关联。本研究中我们发现16个成簇病例之间存在明确的或可能的流行病学关联。根据患者病史资料、全基因组测序数据和流行病学资料，探讨成簇病例之间的传播关系、分析当地结核病传播特征。研究提示：卫生机构诊断延迟≥14天和异烟肼耐药、感染北京基因型菌株是上海市崇明区肺结核传播的主要危险因素。崇明区结核病患者临床菌株成簇率为27.25%（94/345），说明不能忽视传播对崇明区肺结核疫情防控带来的严峻挑战。上海市崇明区结核病家庭内传播情况较为明显，部分成簇病例存在家庭内结核病患者接触史。这提示我们：引入及推进新的快速诊断技术（如测序技术等）实现结核病患者早发现早诊断早治疗、缩短诊断延误时间，能够减少肺结核的传播风险。同时加强对于肺结核患者密切接触者筛查，有助于减少肺结核病的传播。

本研究存在一定的局限性。首先，当地结核病传播水平有可能被低估。由于未收集到上海市肺科医院首诊断肺结核患者培养阳性的菌株，崇明区2009—2018年新诊断肺结核患者中约30%的临床菌株缺失，这可能会低估实际的传播水平，同时会因为部分病例的缺失影响传播链的解析。其次，由于本研究是跨度十年的回顾性研究，通过流行病学调查获得的成簇病例之间的流行病学信息有限，有些成簇病例之间流行病学关联无法证实。然而，本研究的意义在于这是首次在上海市崇明区这个以本地原住居民为主的地区开展的以人群为基础的基因组流行病学研究。十年的长时间研究跨度有助于捕获所有结核病病例，并借助全基因组测序技术在分子水平上解析、追踪传播链，分析当地结核病传播特征。

编辑：李敬文

校对：郭   萌

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