精品文献|PSC的那些事儿，确定不看看？

关键词

PSC无饲养层培养，心脏形成类器官，iPSC疾病模型，心肌细胞，再生医学，分化潜能，基因图谱，基因组稳定性，细胞命运转化，多能干细胞状态，始发态，原发态

多能性干细胞 (PSC) 包括胚胎干细胞 (ESC) 和诱导多能性干细胞 (iPSC)。人ESC (hESC) 分离自发育胚胎的胚泡期内细胞群，于1998年由威斯康辛大学麦迪逊分校的James Thomson博士首次分离获得。iPSC是通过异位表达一个或多个基因来重编程成体细胞而生成的。它们与ESC类似或相当，于2007年由Shinya Yamanaka博士在日本东京首次分离获得。PSC的特点是能够无限制自我更新，当遇到合适的微环境时，可以分化成几乎任意细胞类型。      

iPSC培养系统的选择( feeder vs feeder-free)会影响细胞命运和分化结果

PSC的培养需要一整套兼容的培养基、基质和传代方法，以支持细胞的健康和多能性。 一般来说，PSC培养系统可以分为有饲养层(feeder-independent, 如KSR）和无饲养层系统（feeder-free，如Essential 8/E8）。 有饲养层培养依赖饲养层细胞提供多种生长因子和细胞外基质蛋白。虽然含有大量支持PSC生长的组分，但化学成分不确定还含有动物源成分。面对从基础研究到再生医学的日益严格的PSC培养要求，化学成分完全确定、无动物源成分的无饲养层系统成为了更多科学家的选择。有意思的是，PSC的无饲养层培养可能会影响iPSC基因图谱进而促进下游分化。 

在 Nature Genetics 的一篇文章 “ Molecular and functional variation in iPSC-derived sensory neurons ”里，作者阐明了饲养层系统培养的iPSC (feeder iPSCs)和无饲养层系统培养的iPSC (E8 iPSCs,)在基因图谱上的巨大差异，以及下游分化神经元在基因图谱上的巨大差异， 意味着 iPSC培养系统的选择会影响细胞命运和分化结果。

值得提到的是，差异表达最高的基因包括早期发育调节因子 EMX1（E8 iPSC中的表达量是feeder iPSC的15倍），该基因对神经元分化调控很重要，以及 BMP2（feeder iPSC中的表达量是E8 iPSC的13倍），而该基因已被证明通过拮抗 Wnt/β-catenin16 信号通路来抑制感觉神经元的分化。

在上图数据中，数据展示了E8 iPSC分化能得到更高比例的神经元。由Feeder iPSC 分化的感觉神经元IPSDSN (iPSC-Derived Sensory Neuron) 样本中，细胞外基质、pattern specification和 Wnt 信号传导相关基因表达量更高（e.g. FGFR2）。不同的是， 由E8 iPSC 分化的 IPSDSN 样本中，离子通道复合体、外周神经系统发育和突触形成相关的基因表达量更高 (e.g. SCN9A)。这个结果也预示着 iPSC分化前的培 养体系对细胞命运有潜在影响。 

可以看到，无饲养层培养系统或许更有利于感觉神经元分化。其实，   E8培养基 适用于多种应用场景，比如类器官形成，心肌细胞分化， iPSC疾病模型建立，PSC细胞活性研究，PSC多能性状态研究 (原发态，始发态，中间态)。 针对以上应用方向，本文精选了多篇优质高分文献，希望为大家带来很多启发和帮助。 

类器官形成

虽然类器官模型已被广泛用于研究肠道、大脑、肾脏和其他器官的早期组织发育，但心脏类器官相关研究并不多见。在 Nature Biotechnology 的一篇文章 “ Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development ”里, 作者详细介绍了一种高度结构化的三维心脏形成类器官 (HFO)构建的方法。在类器官形成前，预先将hPSC平铺在 Geltrex 包被平板上，用 E8 培养基 进行培养。当细胞状态比较理想时，作者用 StemPro Accutase 解离细胞并把细胞转移至U型超低吸附板上，继续用 E8 培养基 进行培养。在类器官形成步骤中，作者通过基质包被hPSC聚集体，以及调节小分子的双相 WNT 通路定向心脏分化来生成复杂的心脏形成类器官(HFO)，HFO 的结构与心管形成之前的早期天然心脏原基非常相似，心肌层 (NKX2.5–eGFP-positive)和内核都清晰可见，如下图所示。

提高hPSC细胞质量的新方法

多能干细胞能够进行自我更新，但对体外环境干扰仍然高度敏感，这对其细胞治疗领域的应用提出了挑战。在 Nature Methods 的一篇文章“ A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells ”中，作者介绍了一种全新的高通量筛选策略来确定一种小分子混合物CEPT (Chroman 1、Emricasan、Polyamines 和 Trans-ISRIB)，CEPT可通过阻断损害细胞结构和功能的应激机制来提高hPSC的基因组稳定性、经解离和基因编辑处理的hPSC存活率，显着提高 hPSC 及其分化细胞的质量。值得一提的是，在hPSC培养的方法里，作者选择了 E8培养基 用于hESC和iPSC的维持培养。 

iPSC疾病模型建立

阿尔茨海默病 (AD) 是一种常见的神经退行性疾病，也是导致认知障碍的主要原因。由于对疾病机制的了解不足，AD 尚无有效的治疗方法。虽然大多数研究都集中在神经元细胞上，但星形胶质细胞也被认为有助于 AD 病理学。在 Stem Cell Reports 的一篇文章“ PSEN1 Mutant iPSC-Derived Model Reveals Severe Astrocyte Pathology in Alzheimer’s Disease ”中，作者把携带PSEN1 ΔE9 突变的 AD 患者的体细胞重编程 ( Cytotune 2.0 Sendai kits, Thermo Fisher Scientific ) 为iPSC，iPSC在E8培养基 (Essential 8，Gibco) 中稳定培养和传代一定时间后，进一步诱导分化为具功能性的星形胶质细胞 (AD Astrocytes)。AD 星形胶质细胞表现出阿尔兹海默症病理学的特征，包括b-淀粉样蛋白的高表达、不同的细胞因子微环境和失调的 Ca2+ 稳态。

发育生物学相关的分子机制研究

Wnt 信号通路在胚胎模式形成、干细胞自我更新和细胞周期调控中发挥重要作用。在 PNAS 的一篇文章 “ Wnt signaling recruits KIF2A to the spindle to ensure chromosome congression and alignment during mitosis ”里，作者发现Wnt 信号通路中的 Disheveled蛋白可招募KIF2A 并介导其与有丝分裂纺锤体的结合，而抑制 Wnt 信号通路会导致体细胞和hiPSC的不正常分裂，由此表明Wnt信号通路在调控细胞有丝分裂中的积极作用，为干细胞无限自我更新的分子生物学机制给出了新见解。类似的，作者选择了 E8培养基(Essential 8，Gibco) 用于hiPSC的维持培养。  

心肌细胞分化

多能干细胞研究的最新进展已经对人类疾病的诊断和治疗方法产生了重大影响。 使用hiPSC衍生的心肌细胞 (hiPSC-CM) 进行再生医学、疾病建模和药物发现研究的一个障碍是它们相对于成人心肌的不成熟状态。 在 Journal of Molecular and Cellular Cardiology 的一篇文章 “ Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment ”里，作者阐述了甲状腺激素、地塞米松和胰岛素生长因子-1  的组合(TDI) 对 3D 心脏微组织 (CMT) 中 hiPSC-CM 成熟的影响，这些微组织 (CMT) 展示了天然心肌的大部分特征。 为了减少动物源成分对于实验结果的影响，作者也是选用E8培养基 (Essential 8, Gibco) 用于hiPSC的维持培养 。 

结论

hPSC相关的基础研究和再生医学应用越来越受重视，hPSC的高质量维持培养是得到有效实验结果和新发现的前提。可以看到， Essential 8 无饲养层培养基 深受这些优秀科学家的喜爱，被广泛应用于类器官，细胞分化，iPSC疾病模型，药物发现等前沿研究中。 Gibco的Essential 8培养基只包含PSC稳定生长和维持所需的8种基本组分 ，具有以下优势：

• 一致性 ——相比传统的无饲养层培养基，成分最确定，最大程度地减少差异 

• 经济高效 ——相比其他无饲养层培养基，它可以实现经济且规模可调的PSC培养。

• 稳定性 ——无外源成分且符合cGMP生产要求

该Essential 8 培养基已用于支持 PSC 生长超过50 代，未出现核型异常的迹象，同时保持 PSC 分化为所有三种生殖谱系的能力（图 1-3）

图1. PSC的形态学研究-在加入Gibco™玻连蛋白的Essential 8培养基中培养PSC第4代。  

图2. PSC标记染色一Nanog、Tra-1-60和Sox2染色Essential 8培养基中培养的PSC,在玻连蛋白 包被 的孔板上传至第50代。                                                                                    

图 3.三系分化—对 Essential8 培养基，rhVTN-N包被板培养的 PSC培养物进行外胚层（βIII 微管蛋白，TUJ1）、中胚层（平滑肌肌动蛋白，SMA）和内胚层（甲胎蛋白，AFP）类胚体染色，复染 DAPI（蓝色）。

推荐的基质

Gibco™截短型人重组玻连蛋白 (VTN-N) 为人PSCs的无滋养层培养提供成分确定的表面。在 James Thomson 实验室中已经证实，当与Essential 8培养基结合使用时，采用玻连蛋白的VTN-N变体可以比野生型玻连蛋白更好地支持人多能性干细胞的粘附和存活。           

参考资料

1. 1.Schwartzentruber, J., Foskolou, S., Kilpinen, H. et al. Molecular and functional variation in iPSC-derived sensory neurons. Nat Genet 50, 54–61 (2018). https://doi.org/10.1038/s41588-017-0005-8        

2. 2.Drakhlis, L., Biswanath, S., Farr, CM. et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol 39, 737–746 (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-00815-9        

3. 3.Chen, Y., Tristan, C.A., Chen, L. et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods 18, 528–541 (2021).           https://doi.org/10.1038/s41592-021-01126-2        

4. 4.Oksanen M, Petersen AJ, Naumenko N, et al. PSEN1 Mutant iPSC-Derived Model Reveals Severe Astrocyte Pathology in Alzheimer's Disease. Stem Cell Reports. 2017;9(6):1885-1897. doi:10.1016/j.stemcr.2017.10.016        

5. 5.Bufe A, García Del Arco A, Hennecke M, de Jaime-Soguero A, Ostermaier M, Lin YC, Ciprianidis A, Hattemer J, Engel U, Beli P, Bastians H, Acebrón SP. Wnt signaling recruits KIF2A to the spindle to ensure chromosome congression and alignment during mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Aug 24;118(34):e2108145118. doi: 10.1073/pnas.2108145118. PMID: 34417301; PMCID: PMC8403935        

6. 6.Huang CY, Peres Moreno Maia-Joca R, Ong CS, Wilson I, DiSilvestre D, Tomaselli GF, Reich DH. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. J Mol Cell Cardiol. 2020 Jan;138:1-11. doi: 10.1016/j.yjmcc.2019.10.001. Epub 2019 Oct 23. PMID: 31655038.