海藻酸钠对高血糖的调节作用与血清代谢物和肠道微生物的变化有关

编译：微科盟索亚，编辑：微科盟索亚、江舜尧。

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导读   

2022年3月15日，青岛大学公共卫生学院马爱国教授团队等人在Carbohydrate Polymers发表题为《Modulation of hyperglycemia by sodium alginate is associated with changes of serum metabolite and gut microbiota inmice》的文章。前人的研究表明，不同分子量的海藻酸钠降低餐后葡萄糖的方式不尽相同。我们推测，不同分子量海藻酸钠对高血糖症的调节作用可能与它们对血清代谢物和肠道微生物的差异调节有关。在本研究中，高脂饮食喂养的小鼠补充了高分子量和低分子量海藻酸钠（H-SA，3350kDa；L-SA，131kDa）。我们测量了血糖/脂质参数、血清代谢物和肠道微生物群。与L-SA相比，H-SA更为显著降低了空腹血糖、HOMA-IR、总胆固醇和体脂；H-SA更为显著地富集了血清代谢物，包括一些脂质、支链氨基酸以及维生素D和维生素E的衍生物。这些变化与 H-SA 和 L-SA 对肠道微生物群的差异调节有关。总之，不同分子量海藻酸钠在缓解高血糖方面的不同作用与其对血清代谢物和肠道微生物群的不同调节有关。    

关键词：海藻酸盐，分子量，高血糖，代谢组学，肠道微生物

图文摘要

论文ID

原名：Modulation of hyperglycemia by sodium alginate is associated with changes of serum metabolite and gut microbiota in mice

译名：海藻酸钠对高血糖的调节作用与小鼠血清代谢物和肠道微生物的变化有关

期刊：Carbohydrate Polymers

IF：9.381

发表时间：2022.03.15

通讯作者：马爱国教授

通讯作者单位：青岛大学公共卫生学院

DOI号：10.1016/j.carbpol.2022.119359

实验设计

选择了两种海藻酸钠（高低分子量H-SA、L-SA）。用凝胶渗透色谱法（GPC）测定了海藻酸钠的分子量，并通过核磁共振氢谱（1H NMR）和FTIR光谱探究其分子结构。进行动物实验，以6周龄雄性C57BL/6小鼠为试验对象，经过一周的驯化后，将小鼠随机分为4组（n = 10）：对照组（CON）、高脂饮食组（HFD）、高脂饮食加L-SA组（L-SA）、高脂饮食加H-SA组（H-SA）。喂食12周后，采集小鼠血清、肝脏、胰腺、脂肪组织、结肠和盲肠组织。进行肠道微生物测定、血清代谢组测定、生理生化指标测定及组织学分析。探究不同分子量海藻酸钠对高血糖的调节作用及血清代谢物和肠道微生物的变化。

结果

1 两种海藻酸钠的化学表征

两种海藻酸钠的凝胶渗透色谱（GPC）和分子量标准如图1A和A1所示。两种海藻酸钠的主峰分别出现在13.6 min和15.6 min。GPC结果表明，所研究的两种海藻酸钠的均分子量分别为3350kDa和131kDa。这两种海藻酸钠在下文中称为H-SA和L-SA。这两种海藻酸钠的核磁共振氢谱（1H NMR）如图1B所示。观察到古洛糖醛酸异头质子（G-1）、甘露糖醛酸异头质子（M-1）和交替嵌段C-5（GM-5）和古洛糖醛酸H-5（G-5）的特征峰分别为5.18 ppm、4.80 ppm和4.56 ppm，与前人研究中的数值相近。H-SA和L-SA的FTIR光谱如图1C所示。H-SA和L-SA分别在1638 cm-1和1642 cm-1处发生了羧酸基团C=O键的不对称振动。H-SA和L-SA光谱中1418 cm-1和1402 cm-1处的峰属于C-OH变形振动。在1042cm-1和1038 cm-1处的峰被归属为吡喃糖环的C-O键和C-C键伸缩振动d3112  cm-1和3137 cm-1处的峰属于羟基的伸缩振动。

表1. 两种海藻酸钠的1H NMR分析。

注：AI、AII和AIII代表图1B中5.18  ppm、4.80  ppm和4.56  ppm处的峰面积；G和M分别代表古洛糖醛酸和甘露糖醛酸单体。FG和FM代表G和M单体的百分比；FGG、FMM和FGM代表GG、MM和GM的百分比；这里假设FGM  =  FMG；H-SA：高分子量海藻酸钠；L-SA：低分子量海藻酸钠。

图1. （A）高、低分子量海藻酸钠（H-SA 和 L-SA）的凝胶渗透色谱（GPC）图；（B）H-SA和L-SA的核磁共振氢谱（1H NMR）；（C）H-SA和L-SA的红外光谱图。

2  H-SA和L-SA对高血糖和血脂的差异调节作用

如图2A-F所示，HFD组空腹血糖和HOMA-IR （Homeostatic Model Assessment for Insulin Resistance）显著高于CON组（P <  0.01）；HFD组HOMA - β、HOMA - IS及胰岛素敏感指数均显著低于CON组（HOMA- IS和胰岛素敏感指数，P < 0.05；HOMA-β，P <  0.01）。与HFD组（P <  0.01 ）相比，H - SA组空腹血糖和HOMA-IR显著降低，HOMA - β、HOMA - IS和胰岛素敏感指数（P < 0.01）显著升高。与HFD组（P < 0.05）相比，L - SA组HOMA – IR显著降低。L-SA处理对HOMA-IR的降低作用小于H-SA处理。L-SA处理对空腹血糖、HOMA- IS或胰岛素敏感指数无显著影响。在处理的11周末进行葡萄糖耐量试验（OGTT）。如图2G和H所示，HFD组AUC显著高于CON组（P <  0.01）。与HFD （P = 0.10）相比，H - SA有降低AUC的趋势，而L - SA对AUC（P  =  0.27）无显著影响。如图2I-L所示，HFD组血清TC和动脉粥样硬化指数显著高于CON组（血清TC，P < 0.05；动脉粥样硬化指数，P < 0.01）。与HFD组（P < 0.01）相比，H - SA组血清TC、LDL - C水平及动脉粥样硬化指数显著降低。L-SA处理显著提高血清HDL-C水平（P < 0.05），但对血清TC或LDL-C水平或动脉粥样硬化指数无显著影响。

图2. 高/低分子量海藻酸钠对小鼠高血糖和血脂的差异调节。（A）空腹血糖；（B）空腹血清胰岛素；（C）稳态模型评估-胰岛素抵抗（HOMA-IR），通过空腹血糖×空腹血清胰岛素/22.5计算；（D）HOMA-β，以20×空腹血清胰岛素/（空腹血糖-3.5）计算；（E）HOMA-胰岛素敏感性（HOMA-IS），按22.5/（空腹血糖×空腹血清胰岛素）计算；（F）胰岛素敏感性指数，按1/（空腹血糖x空腹血清胰岛素）计算；（G）第11周结束时的口服葡萄糖耐量试验（OGTT）曲线；（H）OGTT曲线下面积；（I）血清总胆固醇（TC）；（J）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）；（K）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）；（L）动脉粥样硬化指数，由（TC-HDL-C）/HDL-C 计算得出。CON：AIN-93M 饮食喂养的小鼠；HFD：喂食高脂肪饮食的小鼠；L-SA：高脂饮食加低分子量海藻酸钠喂养的小鼠；H-SA：喂食高脂肪饮食和高分子量海藻酸钠的小鼠；与CON组比较，⁎ P< 0.05，⁎⁎ P< 0.01；与HFD组相比，# P < 0.05，## P < 0.01；数据表示为平均值±标准差（CON、HFD 和 L-SA，n=10；H-SA，n=9）。

3  H-SA和L-SA对HFD所致肥胖及组织病理学改变的差异调节作用

HFD组小鼠体重迅速增加；H-SA 和 L-SA显著减缓了这一过程（图3A和B）。第12周时，HFD组小鼠体重显著高于CON组小鼠（P<0.01）。与HFD组相比，H-SA和L-SA组的体重均有所减轻（L-SA，P<0.05；H-SA，P<0.01）。H-SA处理组体重的减少更为显著。H-SA组的肝脏和胰腺重量显著低于HFD组（P<0.05），而 L-SA 组没有表现出这种现象（图3C和D）。HFD组的附睾、肾周和皮下脂肪重量显著高于CON组（P<0.01）（图3E-G）。与HFD组相比，L-SA和H-SA组的附睾、肾周和皮下脂肪重量显著减少（L-SA 组，P < 0.05；H-SA组，P < 0.01）。H-SA 组的效果比 L-SA 组更显著。H-SA和LMW-AGL处理对肝脏和结肠组织的组织病理学影响如图3H-J所示。HFD组肝组织油红O染色面积显著大于CON组（P < 0.05）。与HFD组相比，H-SA处理显著减少肝脏油红O染色面积（P < 0.01）；L-SA则没有显著影响。结肠组织H&E染色显示，HFD组结肠上皮结构部分破坏，杯状细胞数量明显减少，出现大量炎症性性细胞。H-SA 处理恢复了结肠上皮结构和杯状细胞的数量。然而，L-SA处理的效果不显著。

图3. 高低分子量海藻酸钠对小鼠肥胖程度的差异调节。（A）体重；（B）12周实验期间体重增加；（C）肝脏重量；（D）胰腺重量；（E）附睾脂肪；（F）肾周脂肪；（G）皮下脂肪；（H）肝脏油红O染色；（I）肝油红O染色（放大倍数，×400）；（J）结肠组织H&E染色（放大倍数，×200）；CON：AIN-93M 饮食喂养的小鼠；HFD：喂食高脂肪饮食的小鼠；L-SA：高脂饮食加低分子量海藻酸钠喂养的小鼠；H-SA：喂食高脂肪饮食和高分子量海藻酸钠的小鼠；与CON组比较，⁎ P< 0.05，⁎⁎ P< 0.01；与HFD组相比，# P < 0.05，## P < 0.01；数据表示为平均值±标准差（CON、HFD 和 L-SA，n=10；H-SA，n=9）。

4  H-SA和L-SA对血清代谢产物的差异调节作用

SPLS-DA图（图4A）表示了四组的血清代谢物图谱，四组之间具有明显的差异。通过PLS-DA以进一步鉴定四组之间的差异代谢物（图A2）。图4B和表A2-A5中列出了相关差异代谢物的详细信息。根据变化趋势通过分层聚类分析对前70个差异代谢物进行分类，得到了四个聚类（图4C）。在第一组聚类中，36种代谢物在CON组和HFD组之间相似，并且在L-SA和H-SA组中显著增加。这些代谢物主要是单酰基甘油酯、溶血磷脂酰胆碱、丁酸、棕榈酸及其衍生物、维生素D和E的衍生物、缬氨酸和亮氨酸衍生物等。在第二组聚类中，与CON组相比，HFD组中3种代谢物显著增加，而在L-SA和H-SA组中恢复正常水平，这3种代谢物属于维生素D衍生物、琥珀酰乙酰乙酸酯和肠二醇硫酸盐。在第三组聚类中，与CON组相比，HFD、L-SA和H-SA组的25种代谢物显著减少。在第四组聚类中，与CON组相比，HFD组中6种代谢物显著减少，但在H-SA组中恢复。这些6种代谢物是油酸、二十碳六烯酸、棕榈酸钠、硬脂酸和溶血磷脂酰胆碱。基于KEGG的代谢功能分析确定了各组之间代谢途径的差异（图5和表A6-A9）。脂肪酸生物合成/延伸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成/降解，以及α-亚麻酸和亚油酸代谢是CON和HFD组之间差异最大的途径。不饱和脂肪酸的生物合成、糖胺聚糖的生物合成和脂肪酸延伸是H-SA和HFD组之间以及L-SA和HFD组之间的主要差异途径。然而，不饱和脂肪酸途径的生物合成在H-SA和HFD组之间的差异更大；此外，更多的与脂质相关途径，如花生四烯酸代谢、类固醇生物合成和鞘脂代谢，在H-SA和HFD组之间存在差异。抗坏血酸和醛糖酸代谢、磷脂酰肌醇信号系统以及淀粉和蔗糖代谢是H-SA和L-SA组之间的差异途径。

图4. （A）稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）图表示了血清代谢曲线；（B）维恩图表示的组间差异代谢物的数量；（C）组间前70种差异血清代谢物的热图 ；CON：AIN-93M 饮食喂养的小鼠；HFD：喂食高脂肪饮食的小鼠；L-SA：高脂饮食加低分子量海藻酸钠喂养的小鼠；H-SA：喂食高脂肪饮食和高分子量海藻酸钠的小鼠；每组n = 6。

图5. 基于KEGG的代谢功能分析（A）CON和HFD组之间，（B）H-SA和HFD组之间，（C）L-SA和HFD组之间，以及（D）H-SA和L-SA组之间；CON：AIN-93M 饮食喂养的小鼠；HFD：喂食高脂肪饮食的小鼠；L-SA：高脂饮食加低分子量海藻酸钠喂养的小鼠；H-SA：喂食高脂肪饮食和高分子量海藻酸钠的小鼠；每组n = 6。

5 H-SA和L-SA对肠道微生物群组成的差异调节作用

图A3比较了四组处理之间在操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）水平上alpha多样性。四组处理之间的香农和辛普森指数具有可比性。H-SA和L-SA组的Ace和Chao指数略低于CON和HFD组。PCoA图（图 6）显示了H-SA和L-SA组与CON和HFD组能够显著分开（P=0.001）。此外，H-SA和L-SA组在PCoA图中也存在显著差异。LEfSe分析用于在属水平上识别组间特定的差异肠道微生物，结果如图A4所示。分层聚类分析将四组处理的肠道微生物的差异分为四个聚类（图 7）。在第一组聚类中，与CON组相比，HFD、L-SA和H-SA组的5 个细菌属显著增加。在第二组聚类中，与CON组相比，HFD组的8个细菌属显著减少，而在L-SA和H-SA组中恢复到正常水平。在第三组聚类中，与CON 和HFD组相比，L-SA和H-SA组的14个细菌属显著增加。在第四组聚类中，与CON和HFD组相比，L-SA和H-SA组的41个细菌属显著减少。H-SA组在第三组聚类和第四组的聚类变化比L-SA组更为显著。

图6. 海藻酸钠对小鼠肠道微生物群结构的影响。在操作分类单元水平，基于（A）二进制Jaccard和（B）加权UniFrac的主座标分析图。CON：AIN-93M 饮食喂养的小鼠；HFD：喂食高脂肪饮食的小鼠；L-SA：高脂饮食加低分子量海藻酸钠喂养的小鼠；H-SA：喂食高脂肪饮食和高分子量海藻酸钠的小鼠；在CON、HFD和L-SA组中，n=10；在H-SA组中，n = 9。

图 7. 在属水平上，CON、HFD、L-SA和H-SA 组之间肠道差异细菌热图；CON：AIN-93M 饮食喂养的小鼠；HFD：喂食高脂肪饮食的小鼠；L-SA：高脂饮食加低分子量海藻酸钠喂养的小鼠；H-SA：喂食高脂肪饮食和高分子量海藻酸钠的小鼠；在CON、HFD和L-SA组中，n=10；在H-SA组中，n = 9。

6 血糖参数、肠道微生物组成与血清代谢产物的相关性

对H-SA和HFD组之间的差异血清代谢物、肠道微生物和血糖/脂质参数进行Spearman相关分析（图8和表A10）。结果显示，28个血清代谢物和7个肠道细菌属与空腹血糖呈显著负相关，其中8个血清代谢物和2个肠道细菌属也与HOMA-IR呈显著负相关或与HOMA-β呈显著正相关。2种血清代谢物和7种肠道细菌属与空腹血糖显著正相关。此外，12个血清代谢物和3个肠道细菌属与LDL-C呈显著负相关，而11个肠道细菌属与LDL-C呈显著正相关。H-SA和HFD组中差异细菌属和血清代谢物之间的Spearman相关性在图A5中以热图的形式呈现。13个细菌属与血清代谢物呈正相关。14种细菌属与这些血清代谢物呈负相关。

图8. 通过相关性网络确定H-SA与HFD组之间血糖/血脂参数与肠道菌属或血清代谢产物的Spearman相关性。仅呈现相关系数大于0.8以及P < 0.01的相关性；每个六边形和椭圆分别表示血糖或脂质参数和肠道细菌属或血清代谢物；绿色椭圆代表不同的肠道微生物，橙色椭圆代表不同的血清代谢物；红线和蓝线分别显示正/负相关性；线条的粗细代表相关性的强弱；GLU：空腹血糖；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HOMA：稳态模型评估；IR：胰岛素抵抗。

讨论

不同分子量的海藻酸钠对高血糖的差异调节机制尚不清楚。在本研究中，我们试图通过不同分子量的海藻酸钠对血清代谢物和肠道微生物差异调节的关联来进行研究。结果表明，与L-SA相比，H-SA在降低HFD喂养小鼠的空腹血糖、HOMA-IR、TC、LDL-C和体脂方面具有明显优势。这些差异与H-SA和L-SA对肠道微生物群组成和血清代谢物的差异调节有关。

首先，H-SA和L-SA处理对高血糖和血脂的不同影响可能与它们对血清代谢物的差异调节有关。与L-SA相比，H-SA更显著地增加了有利于缓解高血糖的脂质分子的数量。例如，H-SA处理比L-SA处理更显著地增加了棕榈酸、5-甲基十六烷基肉碱、二十碳五烯酰乙醇酰胺和丁酸。棕榈酸被证实具有抗高血糖作用，因为它可以增加丙酮酸脱氢酶活性和葡萄糖氧化作用，并且抑制肝脏脂肪生成。5-甲基十六烷基肉碱是脂肪酸进入线粒体进行分解的重要转运蛋白。二十碳五烯酰乙醇酰胺具有抗炎症特性，有利于缓解高血糖。丁酸是一种重要的具有生物学功能的短链脂肪酸，对于缓解高血糖的有益作用可能归因于其在减少全身炎症和异位脂肪储存中的作用。同样的，我们对代谢功能分析表明，H-SA处理比L-SA处理更显著地影响脂质代谢，例如脂肪酸的合成、脂肪酸延伸、花生四烯酸代谢、类固醇生物合成和鞘脂代谢。H-SA和L-SA处理之间的直接比较也表明H-SA处理增加了淀粉和蔗糖代谢。淀粉和蔗糖代谢的差异可能与H-SA和L-SA在影响食糜粘度、葡萄糖吸附和葡萄糖扩散阻滞能力方面的差异有关。

此外，在H-SA处理中，包括羟基维生素D3、骨化三醇和13'-羟基-α-生育三烯酚在内的维生素D和维生素E代谢物比L-SA处理更显著增加。在前人的研究中，维生素D代谢物已被证实可通过刺激胰岛素分泌和通过激活维生素D受体降低外周胰岛素抵抗来缓解高血糖症。众所周知，维生素E可以缓解氧化应激，这也是缓解高血糖的重要机制。此外，一些支链氨基酸相关的血清代谢物，包括亮氨酸、N-（3 -氨基-2 -羟基-3 - 丙酰）-L-缬氨酸和焦谷氨酰缬氨酸，在H-SA处理中富集。在四氯化碳诱导的肝硬化大鼠模型中，异亮氨酸和亮氨酸通过上调葡萄糖转运蛋白1和4来改善葡萄糖耐受量。Spearman相关性分析结果表明，28种血清代谢物与空腹血糖呈负相关。在H-SA处理中，这28种血清代谢物中属于上述脂质分子的13种代谢物富集，有利于降低高血糖。此外，两种代谢物与空腹血糖、琥珀酰乙酰乙酸和肠二醇硫酸盐呈显著正相关。尤其是在H-SA处理中，这2种血清代谢物显著减少。其次，H-SA和L-SA在缓解高血糖和改善血清代谢物方面的不同作用可能与其对肠道微生物群的差异调节作用有关。Spearman相关性分析结果表明，13个细菌属可能是改善脂质分子、支链氨基酸和维生素D和E代谢物等血清代谢物的原因，这些代谢物有利于缓解高血糖。此外，这13个细菌属中有8个与空腹血糖和/或HOMA-IR直接负相关，包括有Faecalibacterium sp. UBA 1819, Candidatus_Soleaferrea, Faecalitalea,Flavonifractor，Parvibacter， Ruminococcus_torques_group,Muribaculum,和Faecelibaculum。众所周知，Faecalibacterium sp. UBA会产生琥珀酸，琥珀酸被证明有利于通过肠道糖异生缓解高血糖症。Candidatus_Soleaferrea具有抗炎症的作用，对减轻高血糖症有重要作用。14个细菌属与有利于缓解高血糖的改良血清代谢产物呈负相关。在H-SA处理中，这些细菌属丰富度显著减少。同时，这14个细菌属中有6个与空腹血糖和/或HOMA-IR呈正相关，包括脱硫弧菌属、肠杆菌属、 Eubacterium_xylanophilum_group、Defluvitaleaceae_UCG_011，Christensenellaceae_R_7_group和Blautia。脱硫弧菌属是一种硫酸盐还原菌，通常被认为对宿主健康有害。Eubacterium xylanophilum_group与HOMA-IR呈显著正相关。

最后，H-SA和L-SA处理还表现出对体重和体脂的不同调节作用。与L-SA处理相比，H-SA处理在减少HFD小鼠的体重增加和体脂方面表现出更为显著的效果。Li等人的研究表明了海藻酸寡糖处理对体重增加和体脂具有显著的降低作用。不同的是，海藻酸寡糖处理对体重增加和体脂的影响在Wang和Li等人的动物实验中并不显著。不同分子量的海藻酸钠对体重和体脂的调节作用及其机制还有待进一步研究。总的来说，不同分子量海藻酸钠对高血糖的差异调节作用与其对血清代谢产物和肠道菌群组成的差异调节有关。未来的研究需要进一步验证这些关联，例如通过进行无细菌小鼠实验。