武汉大学殷昊团队开发基于CRISPR的新冠快检技术，20分钟内精准检测新冠病毒

撰文 | nagashi 编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

COVID-19大流行仍在持续，一方面是德尔塔 （Delta） 和奥密克戎 （Omicron） 等新冠变异株的相继出现，另一方面是美国、英国和加拿大等西方国家逐渐放松对新冠疫情的防控，在可预见的未来，新冠病毒短期内将很难被彻底清除。 面对这种情况， 如何快速诊断新冠病毒感染，及时采取相应的治疗和隔离措施有助于将新冠疫情的影响降到最低。在当下，RT-PCR 是新冠检测的“金标准”，但整个检测流程十分繁琐，且依赖于熟练的操作人员和精密昂贵的 qPCR 仪。 因此，开发一种无需复杂仪器、能进行实时现场诊断的检测技术对遏制新冠疫情至关重要。 

2022年3月21日，武汉大学 殷昊 教授和张楹教授团队合作，在 Nature 子刊 Nature Biomedical Engineering 上发表了题为： Fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA using suboptimal protospacer adjacent motifs for Cas12a 的研究论文。 该研究开发了基于 CRISPR-LbCas12a 的新冠快速检测工具—— sPAMC ，该方法使用次优 PAM 基序，在允许 crRNA 设计灵活性的同时，还增强了 LbCas12a 介导的荧光探针切割。研究结果显示， sPAMC技术兼具快速性、灵敏性和准确性 ，能在20分钟内完成对新冠病毒 （SARS-CoV-2） 的检测，灵敏性与 RT-PCR 相当 ，在 SARS-CoV-2 真实样本中达到94.2%准确度且无一例假阳性。  

基于 CRISPR 的诊断技术已成为诊断 SARS-CoV-2 十分有潜力的方法。相比于传统的荧光RT-PCR检测方法，CRISPR 检测技术可以在大约一个小时内检测出病毒，并且可以实现无仪器化的现场诊断，避免繁琐而漫长的送样过程。 2017年4月，张锋团队在 Science 发表论文，发明了基于 CRISPR-Cas13 的病毒检测技术。张锋将这种检测技术命名为—— SHERLOCK ，这一与神探夏洛克·福尔摩斯同名的检测技术，可以让被切割的RNA形成条带，形成视觉可见的线索，并直观展示出来。 同时，诺奖得主 Jennifer Doudna 团队也在 Science 发表论文，发明了基于 CRISPR-Cas12a 的病毒检测技术，并将其命名为—— DETECTR 。 

新冠疫情暴发后，张锋和 Jennifer Doudna 将 SHERLOCK 和 DETECTR 用于新冠病毒的检测，其中SHERLOCK检测试剂盒于2020年获得美国FDA紧急授权。 对于基于 Cas12a 的  DETECTR 检测技术，采集核酸拭子后，靶标核酸通过等温扩增技术进行信号放大，随后 Cas12a 蛋白在 crRNA 的引导下，识别等温扩增样品中的特异性核酸序列，当样本中存在病毒的靶序列序列时，crRNA 与该靶序列结合，激活 Cas12a 蛋白的“非特异性”切割活性，并随机切割溶液中的核酸探针。当用短波光照射样本时，阳性样本会发出荧光，而阴性样本则无荧光，从而判断样本中是否含有病毒核酸。  

DETECTR检测SARS-CoV-2的模式图 

遗憾的是，DETECTR 等基于 CRISPR 系统开发的诊断工具虽然在速度上占据优势，但在灵敏度上不足以匹及临床检测的“金标准”——RT-PCR。因此，如何提高CRISPR诊断技术的灵敏度是使其走向临床应用的关键。 在这项最新研究中，殷昊团队发现，在一步 CRISPR 检测中，靶标 DNA 序列的等温扩增和切割过程是同时发生的。这意味着，在等温扩增过程中该体系的靶标 DNA 序列存在损耗，从而降低了最终的检测灵敏度。 因此，研究团队巧妙地设计了一种新的 crRNA，以避免这种损耗。CRISPR 系统要求靶标序列上存在 PAM 基序，LbCas12a 对应的最优 PAM 基序为TTTV （V: A/C/G） ，但在该研究中，研究团队采用了次优 PAM 基序 （NTTV; TTNT） ，可以减少 LbCas12a 对靶标 DNA 分子的切割，同时还能将反应速度加快2-3倍。

采用次优PAM基序的sPAMC的检测速度更快 不仅如此，与使用最优 PAM 基序的一步 CRISPR 检测相比，sPAMC 具有更高的灵敏度和可靠性： 在 RT-qPCR 检测 Ct 值为18.1~35.8的204份咽拭子标本中，sPAMC 检测新冠病毒的灵敏度为94.2%，特异性为100%。此外，即使是在未提取病毒核酸的样本中，sPAMC 可以在10分钟内检测人类巨细胞病毒 （HCMV） DNA 病毒，15分钟内检测新冠 RNA 病毒，两种情况下的检测限与qPCR相当。 并且仅用便携式紫外灯或蓝光灯照射即可观察到结果。  

次优PAM基序介导的一步反应具有更高的灵敏度和可靠性 值得注意的是，并不是所有的 DNA 序列都有 TTTV 基序，这也限制了 crRNA 的灵活设计，而次优 PAM 序列拥有更高的丰度，从而使得检测更加灵活，例如更容易针对新冠病毒的保守序列设计相应的 crRNA，从而检测多种新冠变异株；或者针对突变序列设计 crRNA，从而鉴定感染的是哪一种新冠变异株。

研究模式图 

总而言之，sPAMC 是一种基于 CRISPR 技术开发的新型病毒检测方法，集众多优点于一体：快速 （20min内完成检测） 、易于使用 （对未提取样品进行一步检测） 、灵敏度高 （与RT-qPCR一样灵敏、可靠、灵活） 。 

论文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41551-022-00861-x