【骨麻征途】增强疼痛基础研究的转化信度：动物模型及方法的创新与进步

编译： 金 迪 、蒋鑫 ；审校 ：袁红斌

海军军医大学附属长征医院     

疼痛仍是全球卫生保健的重要难题，镇痛药是目前治疗的主要工具之一，但药物的副作用、药效有限及滥用等问题仍未得到解决。近年来，基础研究发现的许多针对高敏感靶点的备选镇痛药在临床转化过程中相继失败，大多数归咎于药代动力学、临床实验设计、志愿者招募、靶点药物的毒副作用以及较差的动物模型等。迄今为止，唯一明确的止痛药开发成功的案例是降钙素基因相关的肽（CGRP）拮抗剂在偏头痛中的应用，这提示能模拟临床条件的恰当动物模型能加快疼痛靶点的发现、验证及临床应用。

本期我们带来了一篇发表于《Nature Reviews Neuroscience》的综述，作者讨论了过去40年（主要是近5年）疼痛的基础研究采用的方法并分析其变化趋势，进一步探讨了基础研究的现状应如何改变以促进临床转化。重点关注疼痛研究的四个方面：模型生物，造模实验（诱导疼痛的伤害刺激）、实验环境和疼痛评估实验。人体组织亦被推荐用于基础研究以进一步验证动物疼痛模型所确定的靶点及机制。

模型生物

虽然慢性疼痛好发于中年女性，但2009年一篇综述指出，最常用于疼痛研究的动物模型是年轻雄性大鼠。然而，由于转基因小鼠、光遗传及化学遗传等技术的出现，小鼠越来越多的被用于实验。近5年发表在《PAIN》的文章中使用大鼠和小鼠的研究比例基本持平（图1a）。而更大的哺乳动物，例如狗、猪等因体型、费用和饲养等问题很少用于研究。大、小鼠在基础研究中有着各自的优势，例如大鼠行为训练期短，更易进行手术模拟损伤，承受的实验者和操作诱导的压力更少，例如Randall-Selitto 深压实验需要长时间的束缚，因此几乎只在大鼠身上进行。另一方面，小鼠尺寸小，饲养所需成本和空间更少，且减少了药理实验所需的药物量，并更易进行光遗传实验和进行深部神经结构成像。市售转基因小鼠品系丰富，且小鼠组织更频繁地与人类基因表达进行比较，进一步增加了小鼠的使用。

啮齿动物品系对疼痛行为具有显著影响。近5年发表在《PAIN》的基础研究中，不到10%的小鼠研究使用远交系小鼠（例如CD-1；图1b），而大鼠研究中，超过80%都使用了远交系（主要是SD；图 1c)。有一半以上的研究使用了C57BL/6 近交系小鼠，与其他近交系相比，该品系小鼠表现出对热刺激的高敏感性和对损伤引起的超敏反应的快速恢复。另外，广泛使用近交系小鼠的也是期望降低反应变异性，从而减少实验所需的样本量。但临床中对慢性疼痛患者进行相同疾病诊断或标准化疼痛测试时，发现广泛的表型变异。因此，使用远交系造模可能更好地模拟患者疼痛。近5年发表在《PAIN》的研究中，24%同时使用了雌鼠和雄鼠（图1d）。虽然有明确的研究显示疼痛的神经和免疫机制存在显著的性别差异，但既往研究中使用雌鼠造模的仍是少数。慢性疼痛与复杂的生活史息息相关，而大部分实验选择2-3月龄的大、小鼠（相当于人类的15-20岁）更适用于急性疼痛的研究。

因此，作者支持在疼痛研究中继续使用小鼠或大鼠，鼓励使用远交系，并且主张研究纳入月龄较大的动物和两性动物。

图1 1980-2020 年疼痛研究中使用到的啮齿动物分析（纳入了1980、1990、2000、2010 和 2016-2020 年发表在《PAIN》的研究，共506篇，就文章方法和结果部分，具体分析了包括“动物物种”、“性别”和“啮齿动物品系”等方面）；a.使用大鼠或小鼠作为主要模型生物的百分比。2016-2020年间，320 项研究中只有4项分析了使用非啮齿动物；其中3项研究使用了狗，1项研究使用了猪；b.研究使用小鼠品系的百分比；c.研究使用大鼠品系的百分比；1d.研究使用动物性别的百分比（NR：未报道）。

造模实验的选择

关于动物疼痛模型的主要问题之一是损伤模型能否准确反映了患者表型的时间、解剖和病理生理等特征。神经损伤实验诱发神经性疼痛是目前最流行的啮齿动物疼痛模型，有42%的基础研究使用了一种或多种此类损伤（图 2a）。脊神经结扎（SNL）、选择性神经损伤(SNI)和慢性压迫性损伤(CCI)是三种最常用的单支神经病变模型（图 2b），可造成相对局部的疼痛，其中SNL和CCI诱导疼痛的强度随着时间的推移而减弱，但在雄鼠构建的SNI模型没有此现象。此外，虽然这些实验模拟了灼痛（也称为 II 型慢性区域疼痛综合征），但尚不清楚它们的机制基础是否概括了最常见的人类神经性疼痛类型，例如神经根病、带状疱疹后神经痛、糖尿病性疼痛性神经病和神经性腰背痛。因此，动物模型可能简化了人类神经病理性疼痛的空间、时间和生物学复杂性。另一种常见的诱发神经性损伤的方法是使用化疗药物，因其与癌症患者剂量相关副作用有关，所以其诱导的周围神经病变 (CIPN) 模型具有较高的表面效度。

使用炎性物质或通过机械、热损伤组织可在啮齿动物中诱发炎症损伤，常用方法是足底内注射CFA（图 2c）。这种方法易于诱发浓度依赖性损伤，且有延长的超敏反应期。因此，高剂量 CFA诱导疼痛是少数能够真正研究慢性疼痛的炎症实验之一。也可将皮肤和肌肉均切开，如足底切口模型模拟术后疼痛。通过将 CFA 或角叉菜胶直接注射到肌肉或关节中会诱发肌肉骨骼疼痛及关节炎。然而，更有效的方式可通过对关节软组织的手术建立骨关节炎模型，或关节内注射炎性化合物，例如碘乙酸钠。类风湿关节炎模型可通过将胶原蛋白注入关节以诱发自身免疫反应。

图2 1980-2020采用的疼痛模型分析；a 急性、神经病理性、炎性或其他九种疼痛模型所占研究百分比；b 近5年,不同方法构建神经性疼痛模型中所占百分比；c 近5年,不同方法构建炎性疼痛模型中所占百分比 

炎性疼痛模型也被用于模拟腰痛和头痛，在啮齿动物中诱发偏头痛的一种常见方法是将炎性物质直接用在硬脑膜上，也可通过皮下注射硝酸甘油或曲坦类药物。实验性增加压力范式或患者经历的其他常见偏头痛触发因素可能会增加这些模型的转化相关性，包括畏光、畏光和畏声行为测试。由于双足类与四足类动物的显著差异，目前许多用于啮齿动物的腰椎间盘退变和软组织损伤模型，并未观察到临床相关结果，例如活动能力下降或步态变化，因此，应考虑结合不同的病理生理模型。

伤害可塑性疼痛（以前称为“功能性疼痛障碍”、“功能障碍性疼痛”或“特发性疼痛”），定义为尽管没有明确证据表明实际或威胁的组织损伤导致伤害感受改变而引起的疼痛。纤维肌痛是最普遍的伤害性可塑性疼痛，影响全世界约 4% 的女性和 1% 的男性。构建纤维肌痛模型最常用的方法是结合靶向肌肉注射、疲劳、利血平诱导中枢单胺能递质耗竭和多种压力诱导等方法。

除了病理生理原因外，模型还可以按损伤持续时间进行分类。IASP将慢性疼痛定义为持续或复发超过 3 个月的疼痛。在对近5年发表在《PAIN》的文章的分析发现，只有 3% 的临床前疼痛研究符合这一纳入标准；86%的研究在受伤后1个月或更短时间内终止。一只8周的老鼠其成熟速度比人类快45倍，依次换算，啮齿动物在受伤后仅2天就会进入慢性疼痛阶段。事实恰恰相反的，啮齿动物和人类的许多急性疼痛过程发生在相似的时间尺度上，受伤后引起的病生过程并没有如此迅速，例如与损伤相关的免疫细胞募集、神经元传导速度和突触传递在啮齿动物中并不会比人类快45倍。过去，研究者认为慢性疼痛即组织愈合后持续存在的疼痛，这一概念或可用于之后慢性疼痛的研究，即在初始组织损伤已愈合后仍持续疼痛。

为了更好地模拟临床上慢性疼痛的患者群体，可联合使用多种、有效、持久的疼痛模型，并要进一步开发更有效的伤害可塑性疼痛、腰背痛（和其他肌肉骨骼疼痛）及头痛模型，延长研究的时限，以更好地了解慢性疼痛的机制。

实验室环境因素

实验室环境可对啮齿类动物产生压力，是疼痛研究重要的变量（图 3），压力能会对疼痛的伤害反应理产生矛盾的影响，可以表现为疼痛增加（压力诱发的痛觉过敏），亦能由压力诱发镇痛（SIA）。压力的不同影响难以预测，但可能与压力的大小或可预测性或暴露的时长有关。近5年的研究中只有10% 的小鼠研究和 11% 的大鼠研究使用了内部繁育的动物。因此，绝大多数动物可能会经历与商业供应产生的相关压力，但一般而言其生理影响通常会在48小时内恢复正常。饲养笼的各种因素也会影响疼痛行为（图 3a），垫料可以改变鼠的机械敏感性；使用一些丰富环境的物品（例如穹顶或隧道）可以减少损伤后敏感时长；不同的饮食成分也会对行为产生影响；同笼的鼠（或独笼饲养）可对伤害感受影响重大。因此，为了减轻饲养笼产生的环境压力，可同笼饲养2只以上表型相似的同种动物（即同为损伤模型或对照组），笼中放置一个或多个玩具丰富饲养笼环境，并保证食物、水和垫料等物品的同质性。

在行为测试之前和期间，减少所有引起压力的刺激是最关键的。理想情况下，行为测试应该在专门的湿度控制、光控和温度控制的房间内进行（图 3b）。强烈建议不要在行为测试的同一房间内执行安乐死、组织采集和/或抽血程序。从饲养室到测试室的运输，无论是通过推车还是手动，都会暂时提高压力激素皮质酮的循环水平，从饲养笼子中取出并放入测试设备中也是如此。因此，在开始测试之前，给啮齿动物适当的时间来适应实验设备是至关重要的。平均而言，大鼠需要的适应时间明显少于小鼠；大鼠可在10-15 分钟内习惯于金属丝网表面，而不同品系小鼠所花时间在2-4小时不等。近 5年发表在《PAIN》的文章仅一半提到适应时间，大部分为30-59min。

幼鼠对热和机械敏感性方面也呈昼夜波动现象，因此应注意每天在同一时间开始适应期和完成行为测试（尤其是连续实验）。另外，与遗传变异性或其他环境因素相比，实验者间的变异性对行为学测试结果的影响更大，因此，连续实验应由同一实验者进行。预处理、约束小鼠、皮下注射和灌胃等操作都可引起啮齿动物的压力反应，其产生强度与这些活动所需的时长呈正相关。实验设备所用材质、设计也会影响行为结果，例如设备表面会影响引起肢体回缩的机械刺激阈值大小。当大鼠在金属丝网而非塑料表面上反复测试时，可观察到更高、更可变的阈值。此外，在同一环境中重复测试也会影响行为结果，如雄鼠在与先前受伤相关的环境中进行行为学实验时，表现出了与情景相关的超敏反应。动物之间可通过视觉或嗅觉对彼此产生影响，从而在行为学实验时出现疼痛转移。因此，每只动物做完实验后应对设备消毒（减少嗅觉线索），同时尽量限制动物之间的视觉交流。

图3 行为学实验的环境因素；a鼠房可能影响疼痛行为的因素。动物行为会受到房间特征（如湿度、温度和光照周期）或附近其他动物疼痛状态等因素的影响。另外，即使动物在不同的环境中进行实验，饲养笼内的因素也会影响疼痛行为；b 行为学实验室中可能影响疼痛测量的因素。除湿度、温度、照明和实验组小鼠对同伴产生的影响外，转运产生的压力、实验设备、顺序以及束缚或注射等操作也可能影响疼痛测量结果。另外，实验者的存在、性别和经验水平可能是影响疼痛行为的最大因素。

疼痛测量（行为学实验的选择）

临床中，疼痛分级一般由患者描述主观感受/量表来确定，而这显然不适用于动物实验，因此，疼痛引起的相关症状多作为行为学实验的观察指标（图4a）。目前，最常用的啮齿动物疼痛测量的方法是通过实验者提供痛刺激，从而观察、测量动物的反射行为指标（表1）。

近5年发表在《PAIN》的文章中，53%的研究使用机械刺激（图4b），实验者多通过von Frey 测痛仪刺激动物后爪表面得到动物缩足的刺激阈值。然而，不同研究对缩足的界定缺乏统一标准，因此相较于肉眼直接判定，使用高速摄像记录结合机器学习程序，不仅可实现在毫秒时间尺度上分析刺激诱发的爪子缩回过程的多个指标（如爪子高度和速度），也可同时评估多种动作（如缩足、摇晃等）。若使用动态的机械刺激（如刷子、棉签），也可使用该套设备来分析处理数据。鉴于疼痛刺激来源的复杂性，在行为学实验的设计时，应联合动态机械刺激和无害/有害的静态机械刺激实验，更能反映日常生活中面对的各种疼痛刺激。冷热敏感性评估仍常用于疼痛研究。哈格里夫斯实验可实现单独测定每只后爪对辐射或红外热刺激的热阈值（缩爪时长），已成为研究热痛主要方法。冷敏感性则最常通过丙酮蒸发测试或冷板实验进行评估。

图4 疼痛的行为学实验和分析方法；a疼痛测试方法。化学测试中动物会碰触注射了炎性物质的身体部位；冷痛测试评估动接触冷刺激后缩爪所需时间；电刺激引起的疼痛测定评估行为反应的时间和强度；热痛测试评估动物接触热刺激后缩爪所需的时间；机械测痛法通常观察机械刺激引起动物作出反应的方式，或评估引发行为反应所需力的大小；自发行为测量评估非刺激性疼痛引起不同身体部位表现出行为的质量和强度；b 不同年份中，化学、冷、电、热和机械刺激或非刺激疼痛测定方法在当年所有疼痛研究的百分比。 

其他疼痛行为测量由于无实验者施加外源刺激，都被广泛定义为非诱发疼痛测定（表1），包含所有可因持续/自发疼痛引起的反射性、生存性、选择性和条件性行为的改变。在最近的研究中，只有13%的实验结果关注到了持续疼痛（图 4b）。而临床病人的疼痛往往是持续存在的，因此，在诱发行为之外使用非诱发疼痛行为测定，可更好地评估动物整体的疼痛体验。

将致痛剂注入动物后爪或腹部，可造成一段时间内啮齿动物出现与伤害相关的自发行为反应。乙酸引起的扭体、辣椒素实验和福尔马林实验的第一阶段在内的疼痛实验测量了去脑动物中维持的反射行为。另外，对于持续疼痛产生的自主行为评估还可通过对动物舒适感的视/听觉评估。像人类一样，啮齿动物能够通过面部表情体现情绪状态，可通过对比痛苦量表（grimace scles），如眼眶收紧或耳朵位置，以判断动物的疼痛程度。也可通过解剖学特定的保护行为（例如肢体保护和步态变化）或利用动物听觉/超声波发声来测定持续疼痛的强度。

随着神经生物学技术的进步与大数据时代的到来，更客观、公正及持续的啮齿动物行为评估趋于实现。如今，可在测定啮齿动物行为细微差别的同时记录/调控神经系统的活动，也可通过饲养笼监视系统来观察、记录、分析疼痛模型建立前后动物复杂的生存和选择性行为（包括喂食、挖洞、跑轮、梳理毛发、筑巢、悬挂笼盖和寻求奖赏等）。技术的革新为疼痛的基础研究带来了新思路和可能。

操作性和经典条件反射范式也用于一些疼痛研究。条件性位置厌恶（Conditioned place aversion, CPA）和镇痛条件性位置偏爱（Conditioned place preference, CPP）是此类最常用的两个任务。CPA通常在未建模的动物中进行，使用细胞类型特异的光遗传学和化学遗传学方法来确定某个大脑区域或细胞群的活动（或缺乏）是否助于疼痛相关的负面情感状态的产生。CPP主要用于建模动物，以验证药理学、光遗传学或化学遗传学的镇痛或“缓解厌恶状态”效果。操作性条件反射实验，如机械冲突避免实验、操作性足底热实验等可作为诱发实验的补充，有助于确定动物的疼痛耐受性。

除了测痛实验的选择，在实验开始前需定好收集数据的量、频率和时间点，准确采集数据并据此是实验的基础。目前的研究中，采集数据的时间点较少（多为1-2个），若加大数据的采集进行长期研究，可使用曲线下面积分析（AUC）来测量镇痛/疼痛与时间的关系。当然，保证实验者和动物的全程一致性是该实验成功的关键。

人体组织的疼痛建模

基础研究中人体组织及衍生物的使用在逐渐增加，可用于验证镇痛靶点的表达。由于获取新鲜的人类神经组织在空间、时间和经济上仍然具有挑战性，因此，可将人类多能干细胞分诱导化为初级感觉神经元和中枢神经系统中间神经元以进一步行功能分析。这种方法不仅可以比较来自疼痛患者的组织和来自无疼痛患者的组织之间的功能反应，同样，可以生成来自同一患者的疼痛和非疼痛部位的组织。除了神经组织的体外实验，血浆或其他易于收集的组织使用也可能有助于生物标志物的识别。

总结与推荐

活体动物实验是疼痛研究的基石，文章给出了未来基础研究的几项建议 以增加动物疼痛模型的转化相关性 （图5） 。

图5 提高动物疼痛模型的临床转化相关建议

实验前应重点考虑模型生物、测痛实验、实验环境以及行为学实验的数量和类型。增加模型 生物物种、遗传背景、年龄、性别和生活史的变异性可能会 提高基础向临床转化的可行性 。为了确定新的疼痛 靶点 或机制的普遍性，实验者应该使用多种检测方法。应特别注意在疼痛行为 实验 之前和期间尽量减少环境压力 ， 适当的 环境 适应时间对于减轻压力引起的镇痛或痛觉过敏对行为反应的影响是必要的 。 最后，应增加 测痛方法 的数量、类型和分辨 力 ，以便对损伤 引起的 急性期和慢性期的疼痛行为进行更细 致的解释。

使用更异质的动物模型。 遗传、生活史和损伤特异性因素无疑会影响患者的疼痛 ， 因此，应该考虑让这些因素对啮齿动物模型产生更大的影响 。在确定一种镇痛剂有效后 ， 可 在其他损伤模型中 验证 是否同样有效， 包括 性别 和选择的 时间点都是有价值的。 增加非神经病理性疼痛研究和相关行为测定。 腰 背痛和偏头痛是 全球致残的两大原因 ，但与神经 病理 性和 皮肤炎性实验 相比，这些疾病的动物模型很少使用 。 在更受控的环境中进行行为学实验。 尽管鼓励增加生物体和 实验 或损伤的变异性，但压力对啮齿动物疼痛行为的影响 很大，因此 减少疼痛行为 实验 的 异质性 同样重要 。 在动物损伤和愈合过程中收集更多数据。 疼痛的体验会随着时间而改变 ，同样在予镇痛药物时，更 应评估多个剂量和多个时间点 的效果。 药代动力学问题（血浆药物水平、靶点覆盖、脱靶效应） 仍是临床 转化失败的主要原因。 增加疼痛行为测定的多样性和分辨率。 触碰 超敏反应 并非临床疼痛患者的主要症状，而基础研究却过 度依赖von Frey 等实验手段。研究 持续疼痛 涉及的机制虽然 更加复杂，但 这可能提高临床转化的成功率 。 另外，活体动物实验结合人体组织的体外研究，可双向验证新的疼痛靶点。

编译：金迪、蒋鑫

审校：袁红斌 

（本栏目由仙琚制药公益支持，仅供医学专业人士参考）  

原文链接：  Sadler KE, Mogil JS, Stucky CL. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nat Rev Neurosci. 2022 Feb;23(2):70-85. doi: 10.1038/s41583-021-00536-7. Epub 2021 Nov 26. PMID: 34837072.

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