在不同种族的人群中成年哮喘患者的肠道菌群与非哮喘患者大致相似

编译：微科盟如风，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

肠道细菌群落可能使儿童容易患哮喘。然而，人们对这些微生物在成人哮喘中的作用知之甚少。我们的目的是在一个大规模的、多种族的成人观察队列中分析粪便微生物群与哮喘之间的关系。我们使用16S核糖体RNA基因测序技术分析了1632名成人（172名哮喘患者和1460名非哮喘患者）的粪便微生物群组成。我们使用超随机树机器学习模型，评估了肠道菌群特征鉴别哮喘和非哮喘患者的能力。哮喘对肠道微生物群组成的个体间差异贡献了0.019%，差异并不显著（P = 0.97）。通过超随机树分类器模型（参与者工作特征曲线下面积为0.54），无法根据个体微生物群组成将哮喘患者与非哮喘患者区分开来。总之，在一个城市、大型和多种族多队列中，成人哮喘患者与非哮喘患者的粪便微生物群组成没有显著差异。

论文ID

原名：Gut microbiota of adults with asthma is broadly similar to non-asthmatics in a large population with varied ethnic origins

译名：在不同种族的大人群中，成年哮喘患者的肠道菌群与非哮喘患者大致相似

期刊：Gut Microbes

IF：10.245

发表时间：2021.11.8

通讯作者：Robert F. J. Kullberg

通讯作者单位：荷兰阿姆斯特丹大学医学中心

DOI号：10.1080/19490976.2021.1995279

实验设计

前言

哮喘是最常见的慢性呼吸系统疾病之一，超过3亿人有哮喘相关症状。新出现的证据表明，肠道微生物群与儿童哮喘的发生有关。例如，微生物组成不成熟的婴儿5岁时患哮喘的风险增加，新生儿肠道微生物群的破坏可能会促进CD4+ T细胞功能障碍，从而增加儿童过敏性哮喘的易感性。尽管这些发现提供了肠道微生物群决定儿童哮喘发展风险的线索，但人们对这些微生物在成人哮喘中的作用知之甚少。肠道菌群可能会在以后的生活中重新形成——在生命早期的“机会之窗”期间已经对免疫系统产生了终身影响——并且可能不再对成年期产生影响。少数研究的结果表明这一作用是相互矛盾的，描述了成人哮喘和特定的肠道细菌之间的联系，但没有得到其他人的证实。这些差异可能是由于样本量小（最大的研究包括158个病例，几项研究少于40名哮喘患者）、不完整的混杂分析（例如种族）或难以分析的微生物群数据。

在这项研究中，我们使用的数据来自大型和种族多样化的城市环境健康生活（HELIUS）研究，通过经典微生物生态学和超随机的基于树的机器学习模型，指出了没有证据表明基于16S rRNA基因测序微生物群组成的个体差异与成人哮喘之间存在重要关联。

结果

HELIUS研究是一项大型多种族队列研究，研究人员对阿姆斯特丹（荷兰）居民进行随机抽样，按种族分层。通过使用一个大型的、以城市为基础的、种族多样化的队列，我们能够控制几个重要的混杂因素，其中包括种族和近期使用的抗生素等信息（见材料和方法部分）。在排除吸烟史超过10包/年的参与者以避免与慢性阻塞性肺病或其他与吸烟相关的疾病（n = 460）的潜在混淆后，本研究纳入了HELIUS研究的1632名参与者，他们捐赠了粪便样本。在1632名参与者中，172人（10.5%）根据医生自我报告的诊断被认为是哮喘患者。没有自我报告医生诊断为哮喘的参与者被认为是非哮喘患者（n = 1460）。哮喘患者和非哮喘患者在年龄、吸烟史、近期抗生素或益生菌使用情况或样本采集季节方面没有统计学显著差异（表1）。

表1 纳入HELIUS参与者的基线特征。

a. 基于出生国家：如果参与者在荷兰境外出生并且至少有一个父母在荷兰境外出生，或者如果他们出生在荷兰，但父母双方都在荷兰境外出生，则被认为是非荷兰裔；b. 在过去12个月内使用酒精饮料的情况；c. 从47%的参与者那里获得的有关饮食的详细信息；d. 在粪便样本收集前3个月内使用抗生素的情况。

为了评估所使用的哮喘定义的影响，我们使用两种不同的哮喘定义重复了所有分析。首先，使用严格的定义，即仅根据药物使用情况将参与者视为哮喘患者。其次，使用了更广泛的定义，并根据自我报告的症状、药物治疗和/或医生的诊断确定哮喘患者。94名参与者（5.8%）根据他们的药物使用情况判定患有哮喘。根据更广泛的定义，358人（21.9%）被认为是哮喘患者。

通过对16S rRNA 基因V4区（见材料和方法）进行测序来分析粪便微生物群的组成。如前所述，厚壁菌门和拟杆菌门是优势菌门，最丰富的细菌家族属于这些门（例如毛螺菌科、瘤胃球菌科、拟杆菌科）（补充图1）。哮喘对肠道微生物群组成的个体差异贡献了0.019%，差异并不显著（P=0.97；表2）。因此，在通过主坐标分析可视化ß多样性时没有观察到明显的聚类（图1a, b）。当我们在多变量分析中控制潜在混杂因素（参与者特征、近期抗生素使用、样本收集季节性、膳食纤维/脂肪、益生菌和糖皮质激素的使用）时，由哮喘解释的方差没有显著变化（R2 = 0.00016；表2）。与其他决定因素相比，哮喘对个体间差异的贡献很小，因为所有测试变量共同解释了微生物群组成中7.2%的个体差异。在个体间差异的7.2%中，哮喘仅占0.22%（0.00016，总R2为0.072；表2），而种族占42.6%，性别占31.6%，表明哮喘患者的肠道微生物群与非患者的肠道微生物群大体相似。对哮喘使用更严格和更广泛的定义并没有对这些结果产生有意义的影响（补充表1）。当我们排除患有合并症（糖尿病、高血压、心血管疾病、慢性胃肠病、恶性肿瘤、中风和风湿病）的参与者时，我们发现哮喘对微生物群组成的个体差异的贡献相当（0.058%，P=0.71；补充表2）。

表2 哮喘患者与非哮喘患者个体特征与肠道菌群β多样性之间的单变量和多变量相关性分析。

使用加权UniFrac距离通过置换多变量方差分析（PERMANOVA） 进行分析。多变量模型包括性别、年龄、种族、BMI、吸烟状况、饮酒量、饮食变量（总脂肪酸、饱和脂肪酸和纤维）、最近使用的抗生素（粪便样本收集前3个月）、益生菌和糖皮质激素的使用，以及样本收集的季节。Df：自由度。

图1 哮喘对微生物群组成的个体差异的边际贡献。与非哮喘患者（n = 1460）相比，成人哮喘患者（n = 172）的肠道微生物群β多样性加权（a）和未加权Unifrac距离（b）的差异。根据个体微生物群组成，无法区分哮喘患者与非哮喘患者的超随机化树分类器的参与者工作特征曲线 （c）。这并没有因为哮喘的两个可选择的定义而改变：参与者被认为是基于哮喘药物的使用（d）或基于自我报告的症状、药物使用和/或医生的诊断（e）。ROC = 参与者工作特征；AUC =曲线下面积。

接下来，为了研究肠道微生物群组成在单个细菌分类单元上是否存在差异，我们使用了超随机的基于树的机器学习模型（见材料和方法）。该模型无法根据个体微生物群组成将哮喘参与者与非哮喘参与者区分开来（参与者工作特征曲线下的面积（AUC-ROC） = 0.56 ± 0.04；图1c）。当我们对哮喘使用其他定义时，AUC-ROC没有发生有意义的变化（图1d、e），使用两种不同的机器学习方法（随机森林和支持向量机）也没有改变我们的发现（补充图3）。

此外，使用带有和不带有协变量（参与者特征、近期抗生素使用、样本收集季节性、益生菌和糖皮质激素使用情况）的DESeq2模型，在哮喘患者和非哮喘患者之间没有鉴别出差异丰富的类群（Holm校正p值≥0.05）。此外，哮喘和非哮喘参与者之间的微生物群丰富度或Shannon α-多样性没有差异（图2）。

图2 哮喘组与对照组菌群丰富度和Shannon α-多样性差异不显著。成人哮喘患者 （n = 172） 和非哮喘患者（n = 1460）之间的Shannon多样性（a）和丰富度（b）没有显著差异。当参与者根据哮喘药物的使用（更严格的定义）（C）或基于自我报告的症状、药物使用和/或医生的诊断（更广泛的定义）（D）被认为是哮喘患者时，丰富度没有差异。在箱线图中，中心线显示中位数，箱线界限是第一和第三四分位数，以及箱线上方和下方的须线。

在排除患有合并症（糖尿病、高血压、心血管疾病、慢性胃肠道疾病、恶性肿瘤、中风和风湿病）的参与者之后，我们超随机的树模型无法区分哮喘患者和非哮喘患者（AUC-ROC = 0.56 ± 0.04；补充图2），没有发现哮喘和非哮喘参与者之间差异丰富的分类群（Holm校正p值 ≥ 0.05），我们发现哮喘和非哮喘参与者之间的微生物群丰富度或Shannon α多样性没有差异（补充图2）。

最后，我们询问肠道微生物群的组成是否与哮喘的症状控制有关。我们将在过去一年中自我报告的哮喘主诉（呼吸急促和喘息）或使用哮喘药物的哮喘患者（n = 101）与过去一年没有主诉或使用药物的哮喘患者（n=71）进行比较。我们观察到这些组之间的微生物群丰富度（P=0.99）、α-多样性（P=0.6）或β-多样性（P=0.906）没有差异（补充图4）。因此，这些结果表明，基于16S rRNA基因测序的肠道微生物群的组成与所报告的成人哮喘症状控制之间没有关系。

讨论

尽管多项研究表明肠道微生物群与儿童哮喘的发展有关，但对肠道微生物群与成人哮喘之间的关系知之甚少。在本文中，我们指出，与城市、大型和多种族队列中的非哮喘患者相比，成人哮喘患者基于16S rRNA基因测序的粪便微生物群组成没有显著差异。

哮喘对肠道微生物群组成的个体间差异贡献率仅占0.019%，这是微不足道的——尤其是与性别（3.03%）和种族（5.36%）等其他决定因素相比时。我们的超随机树模型无法根据肠道微生物群组成区分哮喘患者和非哮喘患者，这与之前描述的随机森林分类模型一致，该模型在预测哮喘方面几乎没有价值 （AUC-ROC = 0.53），进一步支持了哮喘对基于16S rRNA基因测序的微生物群组成个体差异的贡献可以忽略不计。

早期的研究提供了关于成人哮喘患者差异丰富分类群的相互矛盾的结果。Hevia及其同事报告了哮喘患者中粪杆菌属Faecalibacterium物种的丰度较高，而Wang等人报告了这些物种的丰度较低。肠道菌群可能会在以后的生命中重建——其在生命早期的“机会之窗”期间已经对免疫系统产生了终生影响——并且当微生物群和免疫系统发育成熟时，肠道菌群可能不再参与成人期的变化。此外，粪便微生物群可能不是哮喘的唯一罪魁祸首，因为与哮喘发展相关的T细胞受到小肠微生物群的训练。因此，进一步的研究必须证明，在生命的不同阶段，小肠微生物群是否与哮喘相关。

据我们所知，这是该领域同类研究中规模最大的队列研究，使我们能够控制几个重要的混杂因素。然而，我们的方法也有局限性。首先，哮喘没有通过肺量测定法或气道高反应性来识别可逆气道梗阻，这可能导致了错误的分类。然而，使用更广泛和更严格的哮喘标准进行额外分析并没有改变我们的发现。其次，哮喘被认为是通过不同病理生理途径产生的不同表型的总称。我们不能完全排除粪便细菌在特定表型中的作用。最后，16S rRNA基因测序在物种水平上的分类分辨率是有限的。使用宏基因组测序提高分辨率可能会揭示多样性的差异，并提供对微生物组功能能力的更深入了解。

结论

总之，虽然新出现的证据表明肠道微生物群组成的变化会影响儿童患哮喘的风险，但我们在一个城市、大型和多种族的队列中发现，与非哮喘患者相比，成人哮喘患者的粪便微生物组成没有显著差异。未来的研究应侧重于粪便菌群在特定哮喘表型中的作用或其他潜在机制，例如肠道微生物群的年龄依赖性效应。

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