我国学者证实，刘如谦开发的DdCBE线粒体碱基编辑有严重脱靶效应

撰文 | 王聪

编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

线粒体（mitochondrion），是细胞的“能量工厂”，线粒体内有一套独立于细胞核的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA），人类mtDNA的长度为16569bp，拥有37个基因，编码13种蛋白，这些蛋白都参与细胞的能量代谢。mtDNA突变会带来母系遗传Leigh综合征、线粒体肌病、Leber遗传性视神经病、共济失调舞蹈病、骨骼肌溶解症等几十种遗传疾病。据统计5000个成人中就至少有1个患线粒体遗传病。

近年来，基因治疗技术飞速发展，尤其是以CRISPR为代表的基因编辑技术的进步，让人类治愈遗传疾病成为可能。但CRISPR基因编辑技术对于线粒体遗传病却束手无策，一方面是由于线粒体基因组太短，缺少足够的CRISPR可编辑位点，另一方面是CRISPR基因编辑必须依赖gRNA，而这种外源RNA难以高效导入线粒体内。

2020年7月，刘如谦（David Liu）团队在 Nature 发表了题为：A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing 的研究论文【1】，成功问鼎线粒体研究领域圣杯，开发了一种不依赖CRISPR的碱基编辑器——DdCBE，能够实现对线粒体基因组（mtDNA）的精准编辑，这为研究线粒体遗传病和治疗线粒体遗传病带来了前所未有的工具。

具体来说，刘如谦团队发现并命名了一种细菌毒素——DddA，它可以催化双链DNA（dsDNA）中胞苷的脱氨，将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。将DddA分裂半体与转录激活子样效应子阵列蛋白（TALE）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂融合，产生无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人线粒体DNA中C•G到T•A的转化，且具有很高的靶向特异性和编辑准确性。

但若要使用DdCBE碱基编辑工具治疗人类线粒体突变遗传病，还需要在体内模型中评估其效果和特异性，尤其是在人类胚胎中。

2022年2月1日，Cell Discovery 期刊同期发表了两篇论文【2、3】，这两篇论文均表明，DdCBE可在人类早期胚胎中实现高效的线粒体碱基编辑。

第一篇论文题为：Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE 。通讯作者为上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院章美玲、李文，中科院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉。

该论文表明，DdCBE是一种有效的碱基编辑器，可在人类胚胎线粒体DNA中诱导点突变，并且在8细胞胚胎中的效率要高得多。8细胞注射方法可以帮助生成线粒体疾病模型以及衍生的胚胎干细胞，用于对线粒体DNA中与疾病相关的基因突变进行功能研究。

第二篇论文题为：DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos 。通讯作者为：南京市妇幼保健院许争锋、沈斌、凌秀凤。

该研究首次证明了在人类三原核（3PN）胚胎中进行DdCBE介导的线粒体DNA碱基编辑的可行性（该论文投稿时间更早），表明在人类早期胚胎阶段对线粒体DNA致病突变进行校正的可能性。

2022年3月18日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙研究组、上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院章美玲，作为共同通讯作者在 Cell Discovery 期刊发表了题为：Mitochondrial base editor DdCBE cause substantial DNA off-target editing in nuclear genome of embryos 的研究论文【4】。

该研究利用杨辉团队之前开发的GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）技术，分析了DdCBE对线粒体DNA和细胞核DNA的影响。发现DdCBE在细胞核DNA上产生了大量的基因组范围内的单核苷酸变异（SNV）脱靶效应。

2019年2月，杨辉团队等（左二伟为第一作者）在 Science 发表论文【5】，开发了一种名为GOTI的新型脱靶检测技术，通过在新形成的仅两个细胞的小鼠胚胎中，将单碱基编辑器系统注入两个细胞中的一个。比较这两种细胞的后代，发现胞嘧啶碱基编辑器BE3存在非常严重的脱靶效应，是对照组的20倍以上，而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点，因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。这一发现促进了碱基编辑器的改进。

与BE3碱基编辑器中胞嘧啶脱氨酶APOBEC1对ssDNA的底物偏好不同，DdCBE碱基编辑器中的DddAtox是一种以dsDNA为底物的独特类型的胞嘧啶脱氨酶。这解释了DdCBE比BE3更多的SNV脱靶脱靶效应的原因。

理论上，在DdCBE碱基编辑器会在N端线粒体靶向信号（MTS）引导下进入线粒体，然而结果表明，在哺乳动物细胞中，MTS不能阻止DdCBE进入细胞核。DdCBE会导致严重基因组脱靶效应，这提示了其在医学应用上存在巨大安全风险。此外，该研究对于优化DdCBE技术以研发安全的线粒体DNA碱基编辑器具有指导意义。

利用GOTI技术评估线粒体碱基编辑工具DdCBE在核基因组上的脱靶效应

中国农业科学院深圳农业基因组研究所博士后魏迎辉，李智方、徐奎、冯虎和谢龙为共同第一作者，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙和上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院章美玲为共同通讯作者。

论文链接：

1.https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4

2.https://www.nature.com/articles/s41421-021-00372-0

3.https://www.nature.com/articles/s41421-021-00358-y

4.https://www.nature.com/articles/s41421-022-00391-5

5.https://www.science.org/doi/10.1126/science.aav9973