科研 | Stroke：肠道微生物群失调与脑动脉瘤破裂有关

编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

背景和目的：环境因素对于脑动脉瘤破裂非常重要。然而，肠道微生物群（一种环境因素）与动脉瘤破裂之间的关系尚不清楚。因此，我们比较了未破裂颅内动脉瘤（UIAs）和破裂动脉瘤（RAs）患者的肠道微生物群，以确定导致脑动脉瘤破裂的特定细菌。 

方法：从2019年到2020年，进行了为期一年的多中心前瞻性病例对照研究。收集发病后立即出现稳定UIAs和RAs患者的粪便样本。使用16S rRNA测序分析他们的肠道微生物群。随后，构建了系统发育树，并进行聚合酶链反应以鉴定特定物种。 

结果：本研究共纳入28例RAs和33例UIA。RAs和UIAs患者特征没有差异：年龄、性别、高血压、血脂异常、糖尿病状态、体重指数和吸烟。α多样性无差异；然而，在未加权的UniFrac距离中，β多样性显著不同。在门水平上，RA组弯曲菌属（Campylobacter）的相对丰度大于UIA组。此外，RA组和UIA组的肠道微生物群具有显著的分类差异。然而，弯曲菌属之所以受到关注，是因为它在这些细菌中是公认的致病性。然后，构建了与弯曲菌属相关的可操作分类单元的系统发育树，并鉴定了4个种。对这些种的聚合酶链反应表明，RA组弯曲菌属和溶脲弯曲杆菌属（Campylobacter ureolyticus）的丰度明显更高。 

结论：具有稳定UIAs和RAs患者的肠道菌群特征存在显著差异。弯曲菌属和溶脲弯曲菌属可能与脑动脉瘤破裂有关。

图文摘要

论文ID

原名：Dysbiosis of Gut Microbiome Is Associated With Rupture of Cerebral Aneurysms

译名：肠道微生物组失调与脑动脉瘤破裂相关

期刊：Stroke

IF：7.914

发表时间：2021.11.3

通讯作者：Masatoshi Takagaki

通讯作者单位：日本大阪大学医学院

DOI号：10.1161/STROKEAHA.121.034792

实验设计

前言

未破裂颅内动脉瘤（UIAs）的患病率约为3%。破裂时，约50%的患者死亡，50%的存活患者出现严重并发症。慢性炎症在脑动脉瘤（CA）破裂中起着至关重要的作用。一些人体CA病理学研究和动物模型已经证明CA壁中存在炎症细胞和介质，以及随后的CA壁结构恶化。慢性炎症可能是由涉及环境和遗传因素的多因素过程引起的。尽管遗传因素能发挥适度作用，但环境因素在蛛网膜下腔出血（SAH）的病因中才是主要作用。

肠道微生物群是影响人类病理生理学的环境因素，与各种疾病有关，其中炎症在确定疾病病程和严重程度方面起着关键作用。肠道微生物组与心血管疾病（如动脉粥样硬化）之间的关联已得到证实。在CAs中，一项动物模型研究表明，抗生素消除肠道微生物组能通过炎症调节促进了动脉瘤壁的病理生理学。Hungatella hathewayi也与UIA的发生有关。然而，肠道微生物组与蛛网膜下腔出血之间的关系尚不清楚。

我们假设，稳定型UIAs患者和最终破裂的不稳定型UIAs患者的微生物组类型存在差异，这种差异可能导致动脉瘤壁的慢性炎症和病理生理变化，最终导致破裂动脉瘤（RAs）。为了确定RAs和微生物组之间的关联，我们在发病后立即比较了UIAs和RAs患者的肠道微生物组，并确定了引起RAs的细菌。

结果

1 患者特征

2019年10月至2020年7月，共招募了70名患者。其中，8名患者因非动脉瘤性SAH而被排除在外，1名患者因粪便样本不足而被排除。因此，本研究包括28个RAs和33个UIAs（图SⅠ）。共对33名UIAs患者进行了5.1±3.7年的随访（四分位数范围为2.4-8.0年）。表1总结了患者和动脉瘤的特征。RAs和UIAs患者的特征没有差异，包括年龄、性别、高血压、血脂异常、糖尿病状态、体重指数和吸烟。动脉瘤的特征方面，动脉瘤位置的分布没有差异；然而，RAs的大小大于UIAs（P=0.0017）。

表1. 患者和动脉瘤的特征。

连续变量表示为平均值±SD，分类变量表示为n（%）。BMI表示体重指数；CKD，慢性肾病；DL，血脂异常；HT，高血压；IHD，缺血性心脏病；mRS，改良兰金量表；RA，动脉瘤破裂；UIA，未破裂颅内动脉瘤。*统计学意义。

2 RA组和UIA组之间肠道微生物群的差异

RA和UIA组的OTU数据集包括6529个OTUs，分为314属、104科、56目、25纲和12门。在RA组和UIA组之间，α多样性无差异，α多样性包括微生物群落的物种丰度（由Chao1、observed species和abundance-based coverage estimator表示）及丰富度和均匀度（由Shannon指数、Simpson指数和inverse Simpson指数表示）（图1A）。在β多样性中，未加权的UniFrac距离存在显著差异（r2=0.023，P=0.020，图1B）。

所有患者的优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroides），分别为52.2±11.5%和36.5±13.8%（表2和图1C）。在门水平上，RA组弯曲菌属的相对丰度明显更高（错误发现率，q=0.007；表2）。

在线性判别分析效应大小分析中，我们确定了在RA和UIA组中的相对丰度存在显著差异的3个细菌门、2纲、3目、9科和28属（图2）。28个属的丰度比分析表明，在RA组中富集了23个属。这些属的相对丰度在不同医院之间没有差异（图SII）。在这23个属中，弯曲菌属通常被认为是一个致病菌属，并且是本研究关注的重点。

图1. 破裂动脉瘤（RA）组和未破裂颅内动脉瘤（UIA）组之间微生物多样性和微生物群组成的比较。A，基于observed、Chao1、bundance-based coverage estimator、Shannon、Simpson和inverse Simpson指数的α多样性无显著差异（P>0.05）。B，主坐标分析说明了基于加权和非加权UniFrac距离的RA和UIA组的分组模式。加权UniFrac距离的β多样性没有差异（R2=0.0046，P=0.81），但未加权UniFrac距离的β多样性有显著差异（R2=0.023，P=0.013）。C，细菌在门水平上的相对丰度分布。厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度在两组之间没有显著差异。

表2. 门水平上的相对丰度。

连续变量表示为平均值±SEM。q值根据错误发现率得出。RA表示动脉瘤破裂；UIA，未破裂颅内动脉瘤。*统计学意义。

图2. 破裂动脉瘤（RA）组和未破裂颅内动脉瘤（UIA）组之间的区别分类群。A，使用线性判别分析效应大小（LEfSe）确定RA和UIA组之间的区别分类群。LEfSe分析表明，RA组和UIA组3细菌门、2纲、3目、9科及28属存在显著差异。绿色条形图表示UIA组中含量更高的细菌，红色条形图表示RA组中含量更高的细菌。B，进化分支图根据LEfSe报告了显示不同丰度值的分类群。在RA组中，弯曲菌属从门水平到属水平更为丰富。C，LEfSe揭示的区别类群的热图。RA组中的大多数区别类群在UIA组中不存在。

3 PCR鉴定弯曲菌属和弯曲菌种

弯曲菌属被分为几种：溶脲弯曲菌（C. ureolyticus）、简明弯曲菌（C. concisus）、纤细弯曲菌（C. gracilis）和人弯曲菌（C. hominis）（图3C）。为了阐明16S rRNA的这些结果，对特定细菌进行了PCR。经16S rRNA鉴定的弯曲菌属和弯曲菌种也呈PCR阳性。在一些患者中，未通过16S rRNA鉴定的弯曲菌属和弯曲菌属也被PCR检测发现阳性。因此，通过PCR和16S rRNA检测，RA组的弯曲菌属和溶脲弯曲菌阳性样本数量明显大于UIA组（表3）。与16S rRNA不同，通过PCR，女性弯曲菌属阳性样本的数量大于男性（85.0%对37.5%，P=0.007，图SIII）。

图3. 破裂动脉瘤（RA）和未破裂颅内动脉瘤（UIA）之间的弯曲菌属。A，RA组弯曲菌属的相对丰度显著高于UIA组（P=0.0007）。B，RA组弯曲菌属的检出率高于UIA组（P=0.00013）。***P<0.001。C，基于弯曲菌属16S rRNA的系统发育树。弯曲菌属分为简明弯曲菌、人弯曲菌、纤细弯曲菌和溶脲弯曲菌，并在3家医院进行了鉴定。

表3. 16S rRNA和PCR检测阳性样本数。

分类变量表示为n（%）。q值根据错误发现率得出。PCR表示聚合酶链反应；RA，动脉瘤破裂；UIA，未破裂颅内动脉瘤。*统计学意义。†人弯曲菌的检测方法尚未建立，PCR尚未进行。

4 肠道微生物群在严重程度上的差异

在28名RAs患者中，16名为低级，12名为高级。在高级SAH和低级SAH患者中没有观察到患者和动脉瘤特征的差异（表SIII）。此外，上述3个细菌门、2个类、3个目、9个科和30个属在低级和高级之间没有差异（补充材料图IV）。

讨论

在本研究中，我们使用16S rRNA测序和PCR分析来研究具有稳定UIAs和RAs患者的肠道微生物群以及引起RAs的特定细菌，以确定肠道微生物群与CAs破裂之间的关联。在门水平上，RA组弯曲菌属的相对丰度显著高于UIA组。在线性判别分析效应量分析中，UIAs组和RAs组的肠道菌群的若干分类构型存在显著差异。特别是，弯曲菌属通常被认为是这些细菌中引起传染病的原因。与本研究的对照组（同一国家；图SV）和人类微生物群项目数据集的另一对照组（不同国家）相比，UIA组的弯曲菌属检出率同样低，RA组的检出率明显更高（图SVI）。因此，弯曲菌属的存在通常是罕见的，弯曲菌属可能与RAs有关。构建了与弯曲菌属相关的OTUs系统发育树，并鉴定出4个种。为了阐明这些结果，我们使用PCR鉴定了弯曲菌属。我们发现RA组的弯曲菌属和溶脲弯曲菌以及16S rRNA显著增加。

  1 弯曲菌属对RAs具有特异性

迄今为止，还没有关于人类SAH和肠道微生物群的报告。在动物模型中，研究表明肠道细菌可与CA的破裂有关。这些发现表明肠道微生物群可能与CA的破裂有关。理想情况下，我们应该比较破裂前的肠道微生物群与UIA的肠道微生物群，以确定导致破裂的细菌，但考虑到低破裂率，这是很困难的。因此，我们在本研究中比较了破裂后即刻的肠道微生物群与长期稳定的UIAs患者的肠道微生物群。然而，众所周知，脑损伤本身，例如缺血性中风甚至轻度创伤性脑损伤，会影响肠道微生物群，这在SAH中也是如此。这是因为肠道和大脑之间的沟通受到免疫调节代谢物、肠道肽、神经递质和细胞因子等介质的调节。因此，目前尚不清楚两组之间的差异是否受到SAH应激的影响，还是在SAH发病之前就已发生。一项将中风患者与正常患者进行比较的研究发现，包括未分类的肠杆菌科（unclassifedEnterobacteriaceae）在内的7个属在中风组更为丰富，11个属，包括普氏菌属（Prevotella）和毛螺菌属（Lachnospira），在健康组更为丰富。同样在本研究中，肠杆菌科（志贺氏菌属E. shigella）在SAH组中更为丰富，而Lachnospiracae科（blautia）在健康组中更为丰富。因此，本研究中检测到的大多数细菌被认为受到SAH诱导应激的影响。然而，缺血性中风患者的弯曲菌属水平并未增加。在我们医院之前的一项比较全身炎症反应综合征与对照患者的研究中，弯曲菌属没有增加。我们认为弯曲菌属，而非SAH诱导的应激，可能是RAs特异性的。

  2 弯曲菌属感染的危险因素

溶脲弯曲菌是弯曲菌属相关性胃肠炎的第二常见病原体。此外，弯曲菌属与溃疡性结肠炎、细菌性阴道病和女性生殖道病变有关。溶脲弯曲菌在老年妇女中更为常见。在多项研究中，PPI（质子泵抑制剂）的使用已被报告为弯曲菌感属染的危险因素。此外，已知包括PPI在内的许多药物会改变肠道微生物群组成。然而，在本研究中，RA组和UIA组之间的药物没有差异，药物与弯曲菌属之间也没有关系（表SIV）。在最近的一项研究中，饮酒频率和肠道运动质量被报道强烈影响肠道微生物群的分布；该研究表明，通过病例组和对照组之间的这些变量匹配，在解决与人类疾病真正相关的肠道微生物群成员方面的稳健性和再现性都有所提高。在本研究中，饮酒和服用泻药没有差异，虽然无法详细收集有关排便质量的信息，但这项研究被认为是高度可重复的。

  3 弯曲菌感染导致CAs破裂的机制

在一项体外研究中，感染溶脲弯曲菌的细胞产生的白细胞介素-8水平显著高于阴性对照组。在一项人体研究中，感染弯曲菌属的患者的MMP-8（基质金属蛋白酶8）、MMP-9、髓过氧化物酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶和MMP-1组织抑制剂比健康对照组高2-3倍。因此，弯曲菌属可诱导炎症反应。相反，一些CAs研究发现炎症、中性粒细胞和细胞因子在CA进展和破裂中起着关键作用。因此，弯曲菌属引起的系统增强的细胞因子、中性粒细胞源性蛋白水解和氧化应激可能促进血管重塑和CA壁的细胞死亡，并最终结合血流动力学和遗传学，导致UIA转变为RA。

对CAs的研究仍然具有挑战性。日本人动脉瘤破裂率较高；然而，潜在的关联仍不清楚。目前没有证据表明与日本人具有相似遗传谱系的东亚人破裂率更高。如果遗传因素与CAs破裂无关，则更有可能是环境因素。在几项研究中，已报道了不同人群的肠道微生物群多样性更大。另一项研究报道，日本人群的肠道微生物群与其他人群的肠道微生物群差异很大。在本研究中，我们证明弯曲菌属和溶脲弯曲菌可能与RAs有关。因此，肠道细菌作为CAs破裂的新环境因素的鉴定是值得关注的。

这项研究有几个局限性。首先，其他风险因素，包括遗传学和代谢组学，没有被调查。需要进一步的研究，包括动物模型和纵向人体研究，以确定肠道微生物群与CA破裂之间的因果关系。其次，这项研究是在一个国家进行的，与其他研究相比，在对比当前结果时，注意地区和种族差异很重要。第三，众所周知，弯曲菌属通常通过饮食获得的，然而并没有收集饮食信息。最后，没有准确收集破裂后的时间信息，并且采样前的时间如何影响弯曲菌属的检出率和丰度尚不清楚。在本研究中，RA组和UIA组之间的拟杆菌门-厚壁菌门比率没有差异，这表明我们可以适当地收集样本而不会发生动态变化。

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