【醉翁之艺】睡眠缺乏通过乙酰胆碱能和生长抑素中间神经元介导的海马神经活性抑制记忆巩固

       海马突触可塑性和记忆储存受到警觉状态控制。在人类及动物实验中发现，睡眠缺失会破坏多种海马依赖性记忆的巩固，该现象已在小鼠中得到广泛研究，在小鼠中，仅仅几小时的睡眠剥夺（ Sleep deprivation ， SD ）就能破坏海马介导的物体位置记忆和情景恐惧记忆（ Contextual fear memory ， CFM ）的巩固。最近对参与记忆巩固信号通路的研究中发现，睡眠剥夺能够影响海马信号通路功能，然而，具体作用机制尚不明确。来自美国 Michigan 大学和荷兰 Groningen 大学的 James Delorme 等研究者针对睡眠剥夺与记忆巩固之间的关系进行研究，研究结果于 2021 年 8 月发表在 PNAS 杂志上。

研究内容：

1、学习能够增加海马核糖体蛋白S6磷酸化水平，睡眠剥夺则使其降低

图1学习能够增加海马S6磷酸化水平，睡眠剥夺则使其降低

       首先，明确条件恐惧实验（Contextual fear conditioning，CFC）后睡眠剥夺对CFM巩固的影响。从ZT0开始，小鼠接受单次CFC刺激，然后进行24小时自由睡眠或3h的睡眠剥夺。结果显示，睡眠剥夺小鼠CFM僵直时间显著缩短（图1A）。接着，研究者将小鼠分为四组，分别为非CFC+睡眠组、CFC+睡眠组、非CFC+睡眠剥夺组、CFC+睡眠剥夺组（图1B），研究发现，与睡眠组相比，3h睡眠剥夺组小鼠的海马齿状回（Dentate gyrus，DG）、CA1和CA3区域，pS6（Ser244-277）神经元数量显著减少（图1C和1D），而对pS6（Ser235-236）神经元数量无明显影响。同时，3h睡眠剥夺组小鼠海马DG区Arc+和pS6+神经元数量也显著减少（图1E）。以上结果表明，学习能够增加海马S6磷酸化水平，睡眠剥夺则使其降低。

2、睡眠剥夺小鼠核糖体磷酸化主要集中在GABA能、胆碱能和食欲素能神经元

图2 睡眠剥夺小鼠核糖体磷酸化主要集中在GABA能、胆碱能和食欲素能神经元

       为进一步明确睡眠剥夺引起S6磷酸化水平改变所涉及的细胞类型，根据S6磷酸化水平，使用RNA测序（RNA-seq）方法鉴定睡眠组和睡眠剥夺组中细胞类型差异。使用pS6 亲和标签分离核糖体和相关转录物，并进行pS6翻译核糖体亲和纯化（Translating ribosome affinity purification，TRAP）。结果显示，两组特征性基因（Brown／Magenta）表达量与睡眠时间呈负相关（图2A）。再采用细胞类型特异性表达分析（Cell type-specific expression analysis，CSEA）对细胞类型进行量化，发现睡眠剥夺组中，食欲素能（Hcrt+）／胆碱能（Chat+）神经元，以及GABA能（Pnoc+、Cort+）中间神经元中S6磷酸化水平显著升高（图2B和2C）。

3、睡眠剥夺增加生长抑素（Somatostatin-expressing，Sst+）中间神经元活性

图3 睡眠剥夺增加Sst+中间神经元活性

       既往研究发现，Sst和Npy神经肽与海马DG、CA3和CA1区树突状中间神经元存在共标，对调控神经元活性具有重要的作用。为了明确Sst和Npy等在睡眠剥夺在pS6+细胞中的富集情况，研究者将睡眠剥夺时间延长至5h，结果发现，无论是否接受CFC，睡眠剥夺组小鼠Sst和Npy mRNA水平显著升高，Gad67、Pvalb和Cht mRNA水平也升高（图3A），提示睡眠剥夺pS6+细胞类型涉及Sst+中间神经元和胆碱能神经元。

       与睡眠组小鼠相比，虽然睡眠剥夺组小鼠海马脑区神经元总活性降低（图1），但是海马Sst+中间神经元活性却存在激活。为了进一步明确Sst+中间神经元在睡眠剥夺中的作用，研究者采用SST-IRES-CRE转基因小鼠，并通过TRAP方法分离其mRNAs进行研究发现，Sst-TRAP在胶质细胞（Gfap、Mbp）和兴奋性神经元（Vlugt1、Vglut2）细胞标记物呈现去富集化，而富集在Sst+中间神经元（Gad1、Vgat、Sst、Npy、Crhbp）（图3B）。进一步实验发现，与睡眠组相比，睡眠剥夺组中Sst、Npy和Crhbp mRNA水平没有进一步增加，而Kcnf1（编码电压门控钾离子通道亚基Kv5.1）在Sst+中间神经元中显著升高（图3C）。以上结果提示，睡眠剥夺引起pS6-TRAP Sst、Npy和Crhbp转录增加和活性增强，引起Sst+中间神经元S6磷酸化激活。

4、睡眠剥夺引起海马DG区Sst+中间神经元S6磷酸化水平升高

图4 睡眠剥夺引起海马DG区Sst+中间神经元S6磷酸化水平升高

       为了进一步验证睡眠剥夺对Sst+中间神经元活性的影响，研究者使用免疫组化方法检测了睡眠剥夺组中背侧海马Sst+和Pvalb+中间神经元中S6磷酸化水平（图4A）。结果发现，3h睡眠剥夺引起海马DG区pS6+神经元数量显著减少（图4B），却增加了海马DG区Sst+中间神经元S6磷酸化水平（图4C）。

5、激活Sst+中间神经元，降低海马DG区颗粒细胞活性，损害睡眠依赖性记忆巩固

图5 模拟睡眠剥夺激活Sst+中间神经元，降低海马DG区颗粒细胞活性，损害睡眠依赖性记忆巩固

       睡眠剥夺引起的Sst+中间神经元激活可能对周围海马网络活性产生抑制作用，为此，研究者进一步评估了Sst+中间神经元激活对睡眠依赖性记忆巩固的影响。研究者在SST-IRES-CRE小鼠背侧海马转染病毒（图5A）。为了证实药物遗传操作的有效性，对Sst+中间神经元和周围DG颗粒细胞神经元活性进行评估，在hM3Dq和mCherry小鼠中进行CFC试验并注射CNO，结果发现，与mCherry对照小鼠相比，hM3Dq-mCherry小鼠DG区神经元cFos表达水平显著升高（图5A和5B）。为了进一步评估Sst+中间神经元激活对记忆巩固的影响，发现与mCherry小鼠相比，hM3Dq小鼠在CFC试验中僵直时间显著缩短（图5D）。以上结果表明，激活Sst+中间神经元破坏了睡眠依赖性CFM巩固，而且对周围海马神经网络具有显著抑制作用。

6、抑制Sst+中间神经元增加DG区颗粒细胞活性，改善睡眠依赖性记忆巩固

图6 抑制Sst+中间神经元增加DG区颗粒细胞活性，改善睡眠依赖性记忆巩固

       同样，研究者在SST-IRES-CRE小鼠中转染病毒，建立药物遗传操作。在hM4Di和YFP小鼠中进行CFC试验并注射CNO，结果发现，抑制Sst+中间神经元活性导致海马DG区cFos+神经元数量显著增加（图6A）。与YFP对照小鼠相比，hM4Di小鼠在CFC实验中僵直时间显著延长（图6B）。结果提示，睡眠依赖性记忆巩固能够通过抑制Sst+中间神经元进行调控。

7、胆碱能神经元传入信号通过影响DG区神经网络活性，调控睡眠依赖性记忆巩固

图7 激活胆碱能神经元传入信号，降低DG区神经网络活性，损害睡眠依赖性记忆巩固

图8 抑制胆碱能神经元传入信号，增强DG区网络活性，改善睡眠依赖性记忆巩固

       最后，研究者同样采用药物遗传手段，评估激活或抑制胆碱能神经元对CFM记忆巩固的影响。结果发现，激活胆碱能神经元传入信号能够降低DG区神经网络活性，损害睡眠依赖性记忆巩固（图7），而抑制海马胆碱能神经元传入信号能够增强DG区神经网络活性，改善睡眠依赖性记忆巩固（图8）。 

图9 睡眠剥夺对海马神经网络作用的模式图总结

       海马神经网络模式图总结：睡眠剥夺引起胆碱能和食欲素能神经元向海马传入信号增加，进一步激活Sst+中间神经元（红色箭头表示），周围GABA能信号活性降低（蓝色箭头表示），调控海马神经网络活性。

醉翁之艺 点评

       睡眠缺乏破坏了情景记忆和空间记忆的长期储存，这一过程需要海马参与执行。通过本研究发现，小鼠睡眠剥夺导致海马核糖体蛋白  S6  磷酸化水平降低。通过进一步分析与核糖体磷酸化水平相关的  mRNAs  ，发现睡眠剥夺能够选择性地激活胆碱能向海马输入信号以及激活  Sst+  中间神经元，通过功能验证发现，睡眠缺乏能够激活这两类细胞群，抑制海马齿状回神经元活性，破坏记忆巩固。 近年来，已有大量研究证实睡眠对记忆的形成和巩固都具有重要的作用，发现在学习记忆后发生睡眠剥夺，学习记忆能力将明显受损。这一结果得到包括行为学、生理学、细胞及分子水平的实验证据支持，提出了再刺激  -  巩固理论、突触稳态假说和记忆片段重演重叠理论等，对睡眠依赖性记忆巩固进行解释分析。这些研究主要聚焦于海马脑区和新皮质区域，涉及  cAMP  信号通路、  mTORC1  信号通路、  ERK  信号通路等，且与核糖体蛋白  S6  磷酸化密切相关。本研究从神经环路角度揭示了睡眠剥夺抑制记忆巩固的全新机制，为探索睡眠与记忆巩固之间的关系提出了全新的理论依据。

张欣，吕卓辰

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