西湖大学陶亮团队等揭示艰难梭菌毒素入侵人体“新大门”

艰难梭菌感染是社区和临床最常见的病原菌感染之一，可造成包括腹泻、伪膜性结肠炎、脓毒症在内的一系列病症，严重时危及生命，是一个全球性的公共健康问题。艰难梭菌有5个主要进化分支，其中二型分支由于其强致病性又被称为超毒力分支，是近年来造成多次爆发感染的罪魁祸首。

外毒素B（TcdB）是艰难梭菌致病的关键因子，依据序列差异可分为数个亚型，在毒理和病理上存在一定差异。超毒力分支的艰难梭菌专一性地表达两种TcdB亚型（TcdB2和TcdB4），它们如何侵入肠道上皮从而导致疾病发生是个悬而未决的关键问题。

2022年3月17日，西湖大学生命科学学院陶亮团队等在 Cell 期刊在线发表题为：TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile 的研究论文。

该研究首次报道了组织因子途径抑制物（TFPI）是超毒力艰难梭菌TcdB在宿主中的病理相关受体，并用冷冻电镜方法解析了毒素与受体结合的复合物结构。

研究进而指出TcdB亚家族可分为两大类群：一类包含了TcdB1/3/5等亚型，识别FZD蛋白作为受体；另一类为超毒力分支艰难梭菌中的TcdB2和TcdB4，以TFPI作为受体入侵肠道上皮。

该研究对于揭示和理解艰难梭菌感染的致病机制、和梭菌毒素的进化和工作方式有着重要科学意义，并为艰难梭菌感染的预防和治疗提供了重要的理论依据。

陶亮博士等先前曾报道WNT信号通路受体蛋白FZD是经典艰难梭菌菌株的TcdB1的肠道上皮细胞受体，但FZD无法被来自超毒力分支艰难梭菌的TcdB2和TcdB4所识别。在本研究中，陶亮团队发现FZD敲除的HeLa细胞对TcdB4依旧高度敏感，预示HeLa细胞表达有一类介导TcdB4入侵细胞的未知受体。因此研究者们采用了一种全基因组水平的基于CRISPR/Cas9的基因敲除文库筛选技术，对HeLa细胞文库用TcdB4进行多轮压力选择后锁定了TFPI为候选受体。

图2：(A) 全基因组水平的CRISPR/Cas9基因敲除文库在HeLa中筛选与TcdB4作用相关的细胞因子；(B) CRISPR/Cas9筛选结果，采用NGS 读数和靶向的gRNA数目进行二维展示；(C) CRISPR/Cas9筛选结果，根据每个基因的富集度排序。

利用构建基因敲除细胞系、细胞膜表面蛋白酶处理、基因回补和过表达等细胞和分子生物学手段，研究者们发现TFPI可在细胞表面结合TcdB4并介导后者进入胞内发挥生物学活性，从而起了细胞受体的功能。有趣的是，TFPI在哺乳动物中存在α和β两种主要的同源异构体，α和β形式的TFPI都可以作为TcdB4的受体。TFPIα和TFPIβ在蛋白N端共有两个被称为Kunitz的保守结构域，而TcdB4可以特异性地结合第二个Kunitz结构域（K2）上。

之后，陶亮团队与施一公团队开展合作，利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了分辨率为3.1Å的毒素-受体复合物（TcdB4-TFPI）的三维结构（PDB:7V1N）。令人吃惊的是，TcdB4识别TFPI的结合界面与此前报道的TcdB1识别FZD的结合界面高度重合，反映了TcdB的一个在进化上保守、功能上分歧的受体结合区域。对受体结合区的序列作系统进化分析后发现，TcdB可以分为两个大类：第一类以TcdB1/3/5为代表，识别FZD作为受体；第二类主要包含超毒力分支艰难梭菌的TcdB2和TcdB4，选择识别TFPI作为受体。

图3：(A) 毒素-受体复合物TcdB1-FZD2与TcdB4-TFPI的结构比较。(B) 系统进化分析发现TcdB基于受体结合区域差异可分为两大类，分别识别FZD和TFPI。(C) 艰难梭菌分支I、III、IV、V的TcdB识别FZD作为受体，超毒力分支II的TcdB识别TFPI作为受体。

最后，研究者们利用小鼠模型在体内研究TFPI作为TcdB2和TcdB4受体的生理和病理学意义。TFPI全敲除在小鼠中是胚胎致死的，但敲除TFPI部分同源异构体的小鼠没有明显的发育缺陷，因此作者们构建了TFPIβ敲除的小鼠。通过腹腔注射TcdB4进行毒素挑战实验发现，野生型（TFPIβ+/+）和杂合型（TFPIβ+/‒）小鼠在注射一定剂量的TcdB4后的12小时内全部死亡，而超过60%的纯合型（TFPIβ‒/‒）小鼠存活了下来。病理切片研究发现，野生型小鼠的肾脏在毒素注射后损伤严重，而纯合型小鼠肾脏几乎没有损伤。在艰难梭菌感染发生的主要部位——肠道里，TFPI大量表达于被称为肠道隐窝的结构中。研究者们利用经典的肠道结环模型探讨TFPI作为受体在超毒力艰难梭菌的TcdB破坏肠道上皮中的作用。实验显示含有TFPIK2区域的可溶蛋白可以有效阻止TcdB2或TcdB4对肠上皮的破坏，展现出显著的中和保护作用。

西湖大学生命科学学院的研究员陶亮博士（Lead Contact）和李颜颜博士（施一公团队）为本文的共同通讯作者；西湖大学的博士后罗建华、博士研究生杨琦、博士后张晓峰、科研助理张媛媛、博士后万里为共同第一作者。其它合作作者包括西湖大学的研究员黄晶博士和甄莹博士，博士后占谢超，博士研究生周瑶、贺柳晴、李丹阳，和杭州医学院的研究员金大智博士。此外还感谢波士顿儿童医院/哈佛医学院的董民教授、西湖大学生命科学学院的于洪涛教授和李党生教授在项目进行过程中的支持与讨论。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.02.010