最新科研 | 中国药科大学（Nature子刊）：三甲胺产生菌在促进动脉粥样硬化中的作用

编译：微科盟索亚，编辑：微科盟索亚、江舜尧。

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导读   2022年3月10日，中国药科大学尚靖，李菁，齐炼文团队等人在npj Biofilms and Microbiomes发表题为《Integrated metagenomics identifies acrucial role for trimethylamine-producing Lachnoclostridium in promoting atherosclerosis》的文章。微生物三甲胺（TMA）裂解酶活性通过产生氧化三甲胺（TMAO）的前体TMA促进动脉粥样硬化的发展。TMAO已经得到了很好的研究，但是关于TMA的产生细菌的研究却十分有限。本研究的目的旨在鉴定人类肠道微生物中产生TMA的菌属。我们从包含1751个基因组人类微生物组计划数据库（Human Microbiome Project database），包含4644个肠道原核生物的人体肠道微生物的基因组集（Unified Human Gastrointestinal Genome，UHGG）以及4930个物种水平的基因组数据和来自11个种群的2134个个体的公共肠道宏基因组数据中检索了人类相关微生物的基因组。通过测序序列搜索，我们在来自102个属的216个含TMA裂解酶的物种中发现含有cntA/B、yeaW/X和/或cutC/D的同源序列。我们鉴定了来自5个属的13个具有cntA序列的菌株，以及来自14个属的30个具有cutC序列的菌株，在健康人群中中显示出可检测的相对丰度。含有cutC序列最丰富的两个属Lachnoclostridium属（p = 2.9e-05）和Clostridium属（p = 5.8e-04），被发现在动脉粥样硬化患者中比健康人高得多。L. saccharolyticum与胆碱（底物）一起培育后，能够有效地将胆碱转化为TMA，其转化率高达98.7%，而通过液相色谱-三重四极杆质谱法检测到C.  sporogenes的转化率为 63.8-67.5%。体内试验进一步表明，L. saccharolyticum和胆碱处理可促进ApoE-/-小鼠血清TMAO水平显著升高，且主动脉斑块明显堆积。综上，本研究揭示了肠道细菌L. sugarolyticum对胆碱转化为TMA，从而促进动脉粥样硬化发生发展的意义和作用。      

论文ID

原名：Integrated metagenomics identifies a crucial role for trimethylamine-producing Lachnoclostridiumin promoting atherosclerosis

译名：综合宏基因组学证实了三甲胺产生菌Lachnoclostridium在促进动脉粥样硬化中的重要作用

期刊：npj Biofilms and Microbiomes

IF：7.29

发表时间：2022.03.10

通讯作者：尚靖，李菁，齐炼文

通讯作者单位：中国药科大学

DOI号：10.1038/s41522-022-00273-4

实验设计

       通过三个宏基因组数据库：第一个自2014年9月的人类微生物组计划数据库（Human Microbiome Project database），其中包含1751个细菌菌株，涵盖1253个物种。第二个来自人体肠道微生物的基因组集（Unified Human Gastrointestinal Genome，UHGG），其中包含4644个肠道原核生物的204,938个非冗余基因组组成。第三个基因组数据库包含概括的4930个物种水平的基因组。对TMA裂解酶基因序列进行了生物信息学鉴定。选择来自六大洲的11个种群公开的个体宏基因组序列数据，包括哈扎人（PRJNA278393，坦桑尼亚）、中国人（PRJNA422434）、韩国人（PRJEB1690）、日本人（PRJDB3601）、澳大利亚人（PRJEB6092）、奥地利人（PRJEB7774）、丹麦人（PRJEB2054）、法国人（PRJEB6070）、瑞典人（PRJEB1786）、秘鲁人（PRJNA268964）和美国人（PRJNA275349和PRJNA48479）。研究TMA裂解酶相对丰富度、流行率的差异。研究健康个体与患有大肠癌、腺瘤、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、高血压、肥胖和动脉粥样硬化等疾病患者之间TMA裂解酶相对丰富度的差异及相关性。对含有cutC属的菌株进行同源建模、分子对接和动态模拟分析。同时进行小鼠试验，设置正常组、正常+ L. saccharolyticum组、胆碱组和胆碱+ L. saccharolyticum组四个处理，进行组织切片分析、动脉粥样硬化斑块大小的评估、粪便L. saccharolyticum丰富度以及血清TMAO的定量。

结果

1 产生TMA细菌的分类鉴定

       已知肠道微生物可以分别利用3种TMA裂解酶复合物cntA/B、yeaW/X和cut C/D可以将肉碱、甜菜碱和胆碱转化为TMA。CntA，yeaW和cutC是TMA-裂解酶，而cntB，yeaX和cutD是它们的激活剂（图1a）。根据三个参考数据库，对产生TMA的细菌进行了TMA裂解酶序列进行鉴定。最终的885个TMA裂解酶参考序列是从三个参考数据库中确定的，其中451个来自人类微生物组计划数据库（Human Microbiome Project database），人体肠道微生物的基因组集（Unified Human Gastrointestinal Genome，UHGG），以及来自4930个物种水平基因组的218个参考序列（补充表1）。如补充表2所示，这些序列属于来自102个属的216个细菌物种。具体而言，CntA存在于15个属中，cntB存在于20个属中，yeaW存在于15个属中，而yeaX存在于17个属中（图1b）。而这些所有的属都属于变形菌门（图1b）。CutC分布在放线菌门的3个属中、厚壁菌门的27个属、变形菌门的18个属以及拟杆菌门、Desulfobacterota_A和梭杆菌门等其它的4个门。CutD分布在放线菌门的4个属中，厚壁菌门的39个属，变形菌门的30个属以及其它的10个门，如拟杆菌门、Desulfobacterota_A、网团菌门、梭杆菌门、螺旋体门、热袍菌门和疣微杆菌门（图1b）。此外，cntA/B和yeaW/X存在于15个属，而 cutC/D存在于48个属（图 1c）。值得注意的是，cntA/B和yeaW/X在49个物种中共存（补充表2）。在序列相似性方面，cntA和yeaW的平均序列一致性为81.64%，cntB和yeaX为65.63%（图1d）。与cntA/B和yeaW/X相比，cutC/D的序列一致性较低；cutC和cntA/yeaW为32.27%，cutD和cntB/yeaX为33.60%（图1d）。由于TMA裂解酶cntA/yeaW/cutC通常与其相应的激活剂cntB/yeaX/cutD共存，并且cntA/B和yeaW/X之间存在高度同源相似性，而cutC/D 之间不存在这种现象，因此我们在后续的分析中重点关注cntA和cutC。

图1. 产生TMA细菌的分类鉴定。 （a）TMA裂解酶、cntA/B、yeaW/X和cutC/D三种微生物转化途径示意图；（b）cntA/B、cutC/D、yeaW/X的在门水平和属水平上的分布，加号表明该属含有编码相应TMA-裂解酶的基因；（c）cntA/B、cutC/D、yeaW/X共存属分布的维恩图；（d）3种TMA-裂解酶及其相应激活剂的同源树，数字表示分支连接的TMA-裂解酶之间的平均序列标识；TMA：三甲胺。 2  人体肠道中cntA和cutC的相对丰富度

       从几个公共数据库中获得了一个综合的参考宏基因组序列数据集（补充表 3）。多变量调整分析表明，种群对cntA（27.15 %对总变异的贡献）和cutC（21.02 %对总变异的贡献，补充图 1）的相对丰度（R.A.）起主要作用。共纳入全球645名健康个体，用序列比对法计算三甲胺产生菌的相对丰度。在人体肠道中发现5个属含有cntA，其中埃希氏杆菌属占66.5 %，其次为克雷伯氏菌属占17.7 %，而志贺菌属占15.4 %（图2a ）。不同种群间cntA相对丰富度的累积差异较大（porg = 0.013）。瑞典人有着最高的cntA相对丰富度的累积（4.55 × 10−5），而美国人cntA相对丰富度的累积最低（2.48 × 10−6）（图 2a）。对于cutC，前五个最流行的携带cutC的属是Lachnoclostridium属（22.8％），脱硫弧菌属（13.5％），克雷伯氏菌属（12.5％），梭状芽孢杆菌属（11.2％）和埃希氏杆菌属（7％）（图2b）。cntC相对丰富度的累积在人群中也存在很大差异（porg  = 6.1e-06）。日本人表现出最高的cntC相对丰富度的累积（2.66 × 10−5），而瑞典人cntC相对丰富度的累积最低（2.02 × 10−6）。

       基于人类微生物组计划，对产生TMA细菌菌株进行后续分析，定义了三个数据库来源中的菌株的分类学信息。总共发现13个含有 cntA的菌株具有可检测的相对丰富度，其中8个属于优势菌属埃希氏菌属（图2c，左图）。在系统发育分类中，志贺氏菌属来源的cntA与埃希氏菌属接近。两株来自克雷伯氏菌属和一株来自假单胞菌属的菌株在系统发育树上距离较远，这表明它们的基因序列差异较大。13个菌株种cntA的相对丰度为1.62×10-6 ~2.55×10−5，流行率为1.90 ~ 6.72 % （图 2c，右图）。CutC存在于30个菌株中，在放线菌门、厚壁菌门和变形菌门三个门中具有可检测的相对丰度。cutC的系统发育树有3个主要分支。第一个分支主要来自梭状芽孢杆菌属（相对丰富度，3.71 ×10-8-7.54 × 10−6，流行率，2.20-7.80%）。第二个分支主要来自Lachnoclostridium（RA, 4.54 × 10−6–1.72× 10−5；流行率，3.18–5.53%）和脱硫弧菌属（相对丰富度，3.80 × 10−7–4.61× 0−7；流行率，2.24–4.66%）。第三个分支主要来自埃希氏杆菌属（相对丰富度，1.06 ×10-6-3.99 × 10−6；流行率，1.30-3.41%）和克雷伯氏菌属（相对丰富度，2.25 × 10-6-1.30 × 10−5；流行率，1.73- 4.97%）。其中，含有cutC的最高属是Lachnoclostridium（图2d）。

图2. 人体肠道中cntA和cutC的相对丰富度。来自六大洲的11个人类种群中cntA（a）和cutC（b）的相对丰度分布；柱状图显示不同属的累积相对丰度，饼状图显示相对丰富度属的分布；来自六大洲的详细11个人类种群包括：非洲：HZ（坦桑尼亚的哈扎族）；亚洲：CN（中国）、JP（日本）和KR（韩国）；欧洲：DK（丹麦）、SE（瑞典）、AT（奥地利）和FR（法国）；大洋洲：AU（澳大利亚）；北美洲：US（美国）；南美洲：PE（秘鲁）；通过 Kruskal-Wallis 秩和检验进行了相对丰度的显著差异分析；cntA（c）和cutC（d）的分类鉴定；左侧面板显示系统发育树，突出的分支对应中间面板上不同属的颜色，右面板上的条形图表示不同肠道菌株间的平均相对丰度以及cntA和cutC的流行情况；R.A.：相对丰富度，误差条表示均值±s.e.m。

3  cntA 和cutC与各种疾病的相关性

       随后，我们使用几个公共的病例与对照肠道宏基因组数据集探究了cntA和cutC与各种疾病的相关性，例如腺瘤、结直肠癌、葡萄糖耐受不良、2型糖尿病、心血管疾病、高血压和肥胖（补充表3）。有趣的是，与健康个体相比，cntA的相对丰富度在各个疾病组中没有显著差异。动脉粥样硬化患者与健康个体相比有升高的趋势，但无统计学差异（补充图2）。令人惊讶的是，在动脉粥样硬化患者（Mann-Whitney U 检验，pa  = 0.033 ）中，cutC的相对丰富度显著升高，并且与健康个体相比，其流行率存在显著差异（卡方检验pb  = 0.0091）。此外，与健康个体相比，肥胖患者cutC相对丰度（Mann- Whitney U检验，pa = 0.013 ）显著增加，流行率（卡方检验，pb  = 0.033）同样差异显著（图3a）。在其他疾病中，与健康对照组相比，cutC的相对丰富度无显著差异。与健康个体相比，结直肠癌患者的cutC流行率显著高于健康个体（卡方检验pb  = 0.045）。在进一步分析动脉粥样硬化风险与含cutC属之间的相关性时，我们观察到与健康人相比，动脉粥样硬化患者中的Lachnoclostridium（Mann- Whitney U检验，pa = 2.9e-05）、梭状芽孢杆菌属（pa = 5.8e-04）和Olsenella（pa =0.018）的相对丰富度显著增加（图3b）。其他属的相对丰富度在动脉粥样硬化患者和健康个体之间没有显著差异（图3b）。Lachnoclostridium和梭状芽孢杆菌属的流行率最高。埃希氏菌属（卡方检验pb = 1.6e−06）、克雷伯氏菌属（pb = 0.00046）和脱硫弧菌属（pb = 0.024）的流行率存在显著差异。在该数据集中未检测到厌氧球菌属、Hungatella属和变形杆菌属物种。

图3. cntA和cutC与各种疾病的相关性。（a）上图显示了cutC相对丰富度的分布，下图显示了它们在健康个体和患有各种疾病的患者肠道微生物组中的流行率；（b）上图显示了含有cutC属的相对丰富度，下图显示了与健康对照组相比，含有cutC属在AS患者肠道微生物组中的流行率；边界表示第一和第三四分位数之间的四分位数范围，中心线表示中位数；下图中的黑柱代表相对丰度可以量化的个体数量，而灰色柱代表相对丰富度为0的个体。通过Mann-Whitney-Wilcoxon检验对相对丰度的显著差异进行检测，彩色箱线图表示p < 0.05；CN-AS：来自中国的动脉粥样硬化患者；AT-CRC：来自奥地利的结肠直肠癌患者；AT-adenoma：来自奥地利的腺瘤患者；FR-CRC：来自法国的结直肠癌患者；FR-adenoma：来自法国的腺瘤患者；SE-T2D：来自瑞典的2型糖尿病患者；SE-IGT：来自瑞典的葡萄糖耐受不良患者；CN-HT：来自中国的高血压患者；CN-OB：来自中国的肥胖症患者；R.A.：相对丰度；AS：动脉粥样硬化。

4  模拟试验与体外试验对产生TMA的菌属进行比较

       由于动脉粥样硬化患者的cutC显著升高而cntA没有显著变化，因此我们比较了5个相对丰富度较高含cutC基因菌属的TMA产生能力。我们对不同菌株的胆碱和cutC蛋白进行了同源建模、分子对接和动态模拟分析（具体序列见补充表4）。与 L. asparagiforme DSM 15981 （-4.49 KJ/mol）和L. phytofermentans ISDg （-4.41KJ/mol）相比，来自 L. saccharolyticum WM1的cutC的同源建模结构与胆碱的结合能最低（-4.97 kJ/mol）。此外，来自L. saccharolyticum WM1的胆碱和cutC之间的结合能低于其他四个含有cutC的属（从-4.26 到 -4.82 KJ/mol）（图4a）。在这些含有cutC的属中，cutC的七个活性位点残基都是保守的（图4b）。然而，在V225、M344、V404和M406等7个活性位点附近的位点残基在这些属之间存在差异，这可能是造成cutC酶活性差异的原因。通过动态模拟，来自L. saccharolyticum WM1的胆碱和cutC之间的结合构象在100 ns内相对稳定（图 4c）。在这种结合构象中，胆碱表现出三个氢键与两个关键残基，即 Cys497和 Glu499（图 4d）。这些发现表明L. saccharolyticum WM1对底物胆碱表现出良好的亲和力。补充图3显示了从其他候选含cutC的属中cutC的结合构象。因此，我们选择L. saccharolyticum WM1用于随后的体外和体内实验。我们通过与底物胆碱引起培养来探究几个含有cutC的菌株的TMA产生活性。通过液相色谱-三重四极杆质谱法，使用同位素标记的内标法准确定量TMA的浓度。L. saccharolyticum WM1在12、24、36、48、96h能有效地将胆碱转化为TMA，且呈时间依赖性（图4e）。L. saccharolyticum WM1对不同浓度的底物胆碱（2 mM、4 mM和6 mM）的转化率高于98.68%（图4f）。C. sporogenes BNCC 104015显示出中等的胆碱转化率（63.79–67.51%）。B. fragilis BNCC352061和P. intermedia BNCC336948是两种不含cutC酶的阴性对照菌株，没有表现出将胆碱转化为TMA的能力（小于0.1%）（图 4f）。

图4. 模拟与体外试验对产生TMA的菌属进行比较。（a）基于同源模型，含cutC菌株与胆碱的结合能；（b）产TMA属中cutC的7个位点残基；保守氨基酸位点用红色方框标记，氨基酸位置如上所示，二级结构用背景色表示，黄色代表β折叠，紫色代表α螺旋；星号表示与胆碱的氢键连接；（c）L. saccharolyticum的cutC和胆碱的结合构象复合物在100 ns动态平衡下稳定；（d）AutoDock 预测的结合构象复合物（来自L. saccharolyticum），其中蛋白质显示为cartoon，胆碱显示为sticks；与胆碱具有重要氢键相互作用的残基用虚线标记；（e）左图为L. saccharolyticum与胆碱共培养不同时间产生的TMA的典型色谱图，右图为对应的转化率曲线；（f）柱状图显示了基于各胆碱浓度2、4和6 mM （n = 3）的产TMA属菌株的转化率，使用LC-MS评估TMA产量；误差线表示平均值±s.e.m.；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，通过Mann-Whitney-Wilcoxon检验进行差异检验。

5 L. saccharolyticum 促进ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化的发展

       通过体外培养试验证实了L. sugarolyticum能有效地将胆碱转化为TMA，我们进一步研究了L. sugarolyticum在ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化中的作用。我们比较了以下四组小鼠的动脉粥样硬化表型：正常组、正常+ L. saccharolyticum组、胆碱组和胆碱+ L. saccharolyticum组（图5a）。L. saccharolyticum给药显著提高了小鼠粪便样品中L. saccharolyticum的水平（图 5b）。与正常组（p = 9.9e-04）、正常+ L. saccharolyticum组（p = 3.4e-05）和胆碱组（p = 5.3e-04）相比，胆碱+ L. saccharolyticum组TMA下游代谢物TMAO的血清水平显著升高（图5c）。与正常对照组相比，L. saccharolyticum组和胆碱组的血管斑块和狭窄程度呈增加趋势。胆碱L. saccharolyticum组的血管斑块和主动脉弓狭窄非常明显（图5d）。更重要的是，粪便样品中L. saccharolyticum的水平与血清中TMAO水平（R = 0.31，p = 0.0052）、主动脉病变面积（R = 0.54，p = 0.00024）和血管病变面积（R = 0.48，p = 0.0085，补充图4a）呈显著正相关关系。胆碱的添加显著增加了血管壁的厚度和炎症性细胞浸润和脂质沉积（图5e）。这些变化在胆碱+ L.saccharolyticum处理组的小鼠中更为明显（图5e）。L. saccharolyticum和胆碱给药引发小鼠血管炎症，如Il-1β、Tnf-α、Icam-1和Vcam-1、Mcp-1、Cd68和F480的基因变化所示（图5f）。同样，L. saccharolyticum给药增加了循环中游离脂肪酸（free fatty acid，FFAs）的含量，而其他代谢参数则不受影响（补充图4b）。这些结果表明，L. saccharolyticum丰富度损害了主动脉健康，并有利于动脉粥样硬化的形成，这可能是由于TMAO的产生增加造成的。

图5. L. saccharolyticum促进ApoE -/-小鼠动脉粥样硬化的发展。（a）动物试验的示意图；（b）四组处理小鼠粪便样品中L. saccharolyticum的浓度（n = 20）；（c）四组处理小鼠血清TMAO水平（n = 20）；（d）小鼠动脉粥样硬化斑块图，斑块面积定量结果见底部箱线图（n = 7或8）；边界表示第一和第三四分位数之间的四分位数范围，中心线表示中位数；（e）组织切片的染色结果图，上图为血管组织HE染色结果图，中图为主动脉窦HE染色结果图，下图为主动脉窦油性红染色结果图；血管的比例尺表示为100  μm，主动脉窦的比例尺表示为500 μm；（f）血管内皮细胞组织中相关细胞因子的mRNA表达（n = 8）情况；误差线表示平均值±s.e.m；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，组间差异采用Tukey HSD检验校正的单因素方差分析；N：正常组，用标准食物对照饮食喂养并用无菌培养基灌胃的小鼠；N+L：正常+L. saccharolyticum组，小鼠喂食标准食物并以5×108CFUs/100 μl的剂量灌胃活L. saccharolyticum；C：胆碱组，用添加了1.0%胆碱的标准食物喂养并用无菌培养基灌胃的小鼠；C+L：胆碱+L. saccharolyticum 组，小鼠喂食添加1.0% 胆碱的标准食物，并以5×108 CFUs/100 μl 的剂量灌胃活L. saccharolyticum。

讨论

      在本研究中，通过整合宏基因组学数据，采用了生物信息学和体外/体内验证相结合的方法，表征TMA-裂解酶细菌在促进动脉粥样硬化病变形成中的关键作用。本研究的主要发现有：（1）我们基于三个参考数据库进行了分类学分析，确定了来自102个属的216个产TMA物种。（2）通过使用公开的宏基因组数据分析来自11个种群的2134个个体，我们确定了13个含有cntA和30个含有cutC的菌株。TMA-裂解酶细菌与各种疾病的相关性分析表明，健康个体中含有cutC的丰富度最高的属Lachnoclostridium属在动脉粥样硬化患者中显著增加。（3）L. saccharolyticum WM1是Lachnoclostridium的代表菌株，能够将胆碱有效地转化为TMA，转化率接近100%，远高于C. sporogenes的63%。当与胆碱共同给药时，发现该菌株可提高ApoE-/-小鼠的血清TMAO并促进动脉粥样硬化的形成。本研究揭示了人体肠道微生物群中产生TMA的细菌和转化能力可能能够预测动脉粥样硬化的风险。Falony等人的研究通过挖掘公共基因组数据库，确定了102个具有产生TMA潜力的基因组。随着最新人类宏基因组学数据的出现，我们进行了更全面的分类分析，并从102个属中确定了216个产生TMA的物种。Romano等人从79个人类肠道分离物中鉴定出8个菌株，这些菌株具有将胆碱转化为TMA的能力。与这一研究结果一致，在本研究中鉴定的30个含有cutC的菌株中发现了这8个菌株中的7个。剩下的一个分离菌株，E. tarda ATCC23685，在本研究中被忽略，因为它不包含cutC基因。

       已有的研究表明，心血管疾病的发生与遗传变异、饮食因素和血液中TMAO浓度有关。决定人肠道宏基因组中TMA-裂解酶丰度的因素仍未完全确定。通过观察，我们发现人类种群类别对cntA和cutC相对丰富度有主要的影响，年龄影响较小，BMI和性别则没有显著影响。种群结构还与环境、饮食因素和宿主遗传结构等一些混杂因素有关。由于种群结构在TMA-裂解酶相对丰富度中的重要性，为了避免产生偏差，使用本研究采集的11个全球公开种群数据集至关重要。在相关分析中，我们发现cntA的相对丰富度在动脉粥样硬化患者和健康人之间没有显著差异，这一观察结果与前人的研究结果一致。这可能是由于测序和查询数据库的深度有限造成的。在对cutC的流行率的分析中，我们发现结直肠癌患者明显增高，这与Thomas等人发现在结直肠癌中cutC过量的研究结果一致。值得注意的是，在动脉粥样硬化患者中，cutC的相对丰富度显著升高，而在其他疾病中则变化不明显。Jie等人的研究结果表明，动脉粥样硬化患者和同队列健康个体之间cutC的相对丰度没有显著差异，这与我们的研究结果相反。这种结果的差异可能是由于本研究中检索到的cutC酶的575个查询序列与Jie等人使用的13个序列并列而造成的。移植含cutC共生体的微生物可以促进动脉粥样硬化的发展和血栓形成。Skye等人的研究发现，移植生孢梭菌（一种表达cutC的人类共生体）可以促进在宿主血栓形成的可能性。同样地，我们证实了生孢梭菌在体外可以在体外以63.8-67.5%的中等转化率将胆碱转化为TMA。更重要的是，这项工作首次将Lachnoclostridium 鉴定为最丰富的含有cutC的属，并表明L. saccharolyticum将胆碱转化为 TMA 的比率几乎为100%。

       通过动物模型的验证是确认细菌功能的关键。Backhed等人的研究发现，肠道微生物对动脉粥样硬化的影响具有饮食依赖性的，单一补充胆碱不影响血管斑块大小和主动脉病变。这与我们的研究结果一致，即单次给药ApoE-/-小鼠胆碱或L. saccharolyticum对血管斑块大小的影响不大，但两者联合给药则显著促进动脉粥样硬化病变的形成。脂质是动脉粥样硬化发生发展的重要危险因素。我们在动物模型试验中避免高脂饮食可能是导致血清胆固醇水平无显著变化的原因。同样，本研究存在一定的局限性：（1）基于公共宏基因组数据库整合的宏基因组分析是主要的限制。所有数据集在进行原始测序数据时都受到相同的流水线操作，但由于每个数据集的质量不同，如测序深度和样本量等可能存在一定的偏差。（2）用小鼠模型验证了Lachnoclostridium对动脉粥样硬化进展的影响，因此在进一步的研究中需要进行前瞻性队列研究。我们的研究进行了人类肠道中产生TMA细菌的宏基因组分析，并首次报告了产生TMA的Lachnoclostridium属，该属在动脉粥样硬化患者中显著富集。具体而言，我们验证了L. saccharolyticum WM1可以在体外产生TMA，提高血清中的TMAO水平，并在体内加速血管斑块形成。因此，靶向Lachnoclostridium可能作为治疗动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。