联合代谢激活剂治疗可改善非酒精性脂肪肝患者的肝脏脂肪情况

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指肝脏中过量的脂肪堆积。在动物实验和人体动力学研究中，我们发现复合代谢激活剂（CMAs）给药可促进脂肪氧化，减轻由此产生的氧化应激，激活线粒体，并最终清除肝脏中多余的脂肪。本研究中，我们在一项为期10周的安慰剂对照研究中测试了CMA对NAFLD患者的安全性和有效性。我们发现CMA显著降低肝脂肪变性和天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、尿酸和肌酐水平，而在调整体重减轻后，安慰剂组在这些变量上没有发现差异。通过将临床数据与血浆代谢组学、炎症蛋白质组学以及口腔和肠道宏基因组学数据相结合，我们揭示了与NAFLD患者肝脏脂肪减少和炎症相关的潜在分子机制，并确定了参与宿主-微生物组相互作用的关键参与者。总之，我们研究表明CMA可用于制定NAFLD患者的药物治疗策略。

 论文ID

原名：Combined metabolic activators therapy ameliorates liver fat in nonalcoholic fatty liver disease patients

译名：联合代谢激活剂治疗可改善非酒精性脂肪肝患者的肝脏脂肪情况

期刊：Molecular Systems Biology

IF：11.429

发表时间：2021.10.25

通讯作者：Jan Boren, Adil Mardinoglu

通讯作者单位：瑞典哥德堡大学和萨尔格伦斯卡大学医院，瑞典皇家理工学院，英国伦敦国王学院

DOI号：10.15252/msb.202110459 

实验设计

结果

1 患者特征

在接受试验的56名患者中，32名符合资格标准（见材料和方法以及补充附录）并被随机分配接受治疗或安慰剂。根据研究方案（数据集EV1-EV3）排除了24名患者，一名符合条件的患者在随机分配前搬到了另一个城市。在其余31名符合条件的患者（24名男性和7名女性）中，20名被随机分配到CMA组，11名被随机分配到安慰剂组（图1A）。由于COVID-19封锁，一名患者被排除在分析之外。其余30名患者完成了研究（图1A）。但是，由于COVID-19的封锁，有8人无法到达第14天访问的试验地点，但在第70天完成了最后访问。研究期间通过电话对这些患者进行了仔细监测。患者的平均年龄为40.4岁（25-63岁），77.4%为男性（表1）。各组之间的基线人口统计学和临床特征没有差异（表1，数据集EV4）。

图1. CMA改善肝脏脂肪和临床参数。A 用于测试非酒精性脂肪肝患者CMA效果的研究设计。B–F （B）CMA组和安慰剂组在减肥调整后第0天、第14天和第70天的临床变量差异，包括（B）肝脂肪、（C）ALT、（D）AST、（E）尿酸和（F）肌酐的血浆水平。Adj. P表示重量损失调整后的P值。统计显著性的定义基于配对Student’s t-检验，P < 0.05。方框显示了不同组中临床参数的分布。框的底部和顶部代表第25和75个百分位。中心带表示中值。须线表示非异常值的最小值和最大值，点表示异常值。在每个箱线图中标记第0天、第14天或第70天的样本量。

表1. 研究人群的基线人口统计数据以及体重减轻调整后CMA组和安慰剂组显著不同的临床参数的总结。ALT：丙氨酸转氨酶；天冬氨酸转氨酶；FC：折叠变化。P < 0.05。

a体重减轻调整后的调整P值。

  2 CMA减少肝脏脂肪变性并改善临床参数

治疗方案的依从性超过95%，组间没有差异。主要结果变量，即根据磁共振成像（MRI-PDFF）估计的质子密度脂肪分数判断的肝脂肪含量，在CMA组的第70天低于第0天（10%，P = 0.028），但这种现象没有在安慰剂组发现（图 1B，数据集EV3和EV4）。调整体重减轻后，CMA组的差异仍然显著（P = 0.033）（图 1、表 1)。CMA组（39%，P=0.0003与第0天相比）和安慰剂组（22%，P=0.025）在第70天的血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平较低；然而，在体重减轻调整后，只有CMA组的差异仍然显著（P = 5.75e-07，表1)。第14天，体重减轻调整后的ALT水平仅在CMA组显著降低（24%，P = 0.0015）（图 1C，表 1，数据集EV4）。同样，CMA组（30%，P=0.004）和安慰剂组（20%，P=0.009）在第70天的血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平与第0天相比较低;然而，在体重减轻调整后，AST水平仅在CMA组显著降低（P = 1.58e-05）（图 1D，表 1，数据集EV4）。

CMA组的血清尿酸水平在第14天（12%，P. adj=0.003）和第70天（15%，P. adj=1.12e-05），在体重调整前后均较低（图 1E，表 1，数据集EV4）。仅在CMA组（8%，P. adj=0.0007），在体重减轻调整前后，第70天的肌酐水平显著降低（图1F，表1，数据集EV4）。安慰剂组的血清尿酸和肌酐水平在任一时间点都没有变化（表1，数据集EV4）。CMA组第70天的收缩压降低5%（P=0.023），而安慰剂组没有变化，舒张压升高（P=0.038）（数据集EV4）。

  3 CMA改变血浆代谢物

为了描述患者特征并揭示与CMA组肝脂肪减少和临床参数改善相关的潜在分子机制，我们从血浆样本中生成了非靶向代谢组学数据，并测量1032种代谢物的水平（数据集EV5）。排除>50%样本中缺失值的代谢物后，分析了929种代谢物（数据集EV5）。数据集EV6中列出了第70天和第14天与第0天的代谢物水平在减肥调整前后存在显著差异；数据集EV7中列出了各组之间的差异。

在第70天，与CMA直接相关的丝氨酸、烟酰胺和肉碱以及与CMA间接相关的代谢物的血浆水平在CMA组中显著高于第0天（图2A，数据集EV6），并且这些水平为显著高于安慰剂组（数据集EV7）。具体而言，在CMA组中N1-甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺、N1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺和1-甲基烟酰胺的血浆水平（与NR和NAD+代谢相关）；N-乙酰甘氨酸、N-棕榈酰丝氨酸、N-油酰丝氨酸和N-硬脂酰丝氨酸（与丝氨酸和甘氨酸代谢相关）以及脱氧卡尼汀、乙酰卡尼汀和丁酰卡尼汀（与肉碱代谢相关）在第70天的含量显著高于第0天（数据集EV6）。另一方面，我们发现与NAC相关的血浆半胱氨酸水平呈下降趋势（P = 0.052）与CMA组第0天相比在第70天下调（图 2A，数据集EV6）。因此，我们观察到NAC与其他三种代谢激活剂相比具有不同的血浆动力学。我们研究了单个代谢激活剂的血浆水平与代谢物的血浆水平之间的关联（图 2B，数据集EV8）。我们为除使用的代谢激活剂之外的血浆水平代谢物的变化提供了可靠解释。

我们发现，在第70天和第0天，110种代谢物存在显著差异（P < CMA组为0.05）；44种代谢物参与脂质代谢（图 EV1），66种代谢物参与氨基酸和代谢的其他部分（图 3A，数据集EV6）。在CMA组第70天与第0天有显著差异的66种代谢物中，两组中有4种代谢物有显著差异（图 3B），其中62个仅在CMA组中存在显著差异（图 3C），其中27个仅在安慰剂组中存在显著差异（图 3D）。在此之前，我们发现血浆犬尿氨酸和犬尿氨酸水平升高与高肝脂肪有关。在CMA对血浆代谢物水平的急性影响的一天临床研究中，我们发现犬尿氨酸和犬尿氨酸水平显著降低。在当前的研究中，CMA组在体重减轻调整前后（数据集EV6），犬尿酸盐（图3B）和犬尿氨酸（图3C）的血浆水平在第70天与第0天相比显著降低。另一方面，与安慰剂组第0天相比，第70天犬尿酸盐血浆水平显著增加（图3B）。此外，我们发现血浆中3-氨基-2-哌啶酮水平与尿素循环有关；与第0天相比，CMA组的精氨酸和脯氨酸代谢在第70天显著降低，而安慰剂组的血浆水平显著升高（图 3B）。

我们的分析还显示，在第70天，CMA组的嘌呤和黄嘌呤代谢降低。在第70天，CMA组的血浆尿酸盐、黄嘌呤、次黄嘌呤5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶、1,7-二甲基尿酸盐和茶碱水平显著降低（图 3C，数据集EV6）。与这些发现一致，该组患者的血浆尿酸水平显著降低。N-三甲基-5-氨基戊酸盐（TMAVA）是CMA组在减肥调整前后第70天最显著减少的代谢物（图 3C，数据集EV6），显著低于安慰剂组（数据集EV7）。TMAVA与肠道微生物有关，且与赖氨酸代谢有关，是微量白蛋白尿的最佳预测因子之一。在先前的研究中，NAFLD患者血浆TMAVA水平显著升高。粪肠球菌和铜绿假单胞菌负责将三甲基赖氨酸代谢为TMAVA，TMAVA在小鼠模型中通过抗生素治疗进一步调节。我们还发现，在第70天，即使在体重减轻调整后，CMA组的血浆N，N，N-三甲基-丙氨酰脯氨酸甜菜碱（TMAP）水平也显著下调（图 3C，数据集EV6），以及肌酐水平也是如此（图1F，表1，数据集EV4)。TMAP被描述为一种新的透析清除率的潜在生物标志物，可以准确地定义肾功能。

CMA治疗与血浆丝氨酸、甘氨酸、γ-谷氨酰甘氨酸、肉碱、TMAVA、1-甲基烟酰胺、N1-甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺和N1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺水平显著相关（图 2B，数据集EV8）。但这些代谢物均与血浆半胱氨酸水平无显著相关性，表明半胱氨酸利用率不同于CMA中的其他代谢物。

图2. 补充可提高血浆代谢激活剂水平。A在第 0、14 和 70 天，在 CMA 和安慰剂组中显示了包括丝氨酸、肉碱、半胱氨酸和烟酰胺在内的单个 CMA 血浆水平的差异。Adj.P表示体重减轻调整后的P值。统计显著性的定义基于配对Student’s t-检验。P < 0.05。方框显示了四种代谢物在不同组中的丰度分布。y轴是log10变换。框的底部和顶部代表第25和75个百分位。中心带表示中值。须线表示非异常值的最小值和最大值，点表示异常值。在每个箱线图中标记第0天、第14天或第70天的样本量。B 介绍了单个CMA的血浆水平与10种最显著相关的血浆代谢物之间的相关性。星号表示基于Spearman相关分析的统计显著性（FDR<0.05）。只有在超过50%的样本中检测到的代谢物才包括在分析中。Cor.Coeff：相关系数。

图3. CMA改变血浆代谢物水平。在体重减轻调整后，CMA组和安慰剂组在第70天和第0天之间代谢产物（脂质除外）的血浆水平存在显著差异。A维恩图表示CMA组和安慰剂组在第70天与第0天的代谢产物（脂质除外）数量显著不同。统计显著性的定义基于配对Student’s t-检验。P < 0.05。CMA组和安慰剂组的66和31种代谢物（脂质除外）在第70天与第0天分别存在显著差异。两个代谢物列表有四个重叠。B-D在第 70 天与第 0 天 (B) 中显著不同代谢物的血浆水平之间的关联 (n = 4)；(C) 仅在 CMA (n = 62) 和 (D) 仅在安慰剂组 (n = 27) 中显示。热图显示了第70天与第0天之间代谢物的log2FC值。星号表示基于配对Student’s t-检验的统计显著性。P < 0.05。Log2FC表示log2（折叠变化）。

图EV1 . CMA影响血脂水平。调整体重后，CMA组和安慰剂组在第70天与第0天的血脂水平存在显著差异。A维恩图表示CMA组和安慰剂组在第70天与第0天发现的脂质数量显著不同。交叉点代表两组中显著不同的脂质。B–D 两组血浆脂质（B）水平显著不同（n = 2); （C） 仅在CMA组（n = 39）和（D）仅在安慰剂组（n = 23）第70天和第0天比较。热图显示脂质中基于log2FC的变化。星号表示基于配对Student’s t-检验的统计显著性。P<0.05。Log2FC表示log2（折叠变化）。

  4 CMA可减轻炎症

使用血浆蛋白质组分析平台邻近延伸分析（PEA）测量96个炎症蛋白标记物的血浆水平，使用炎症面板量化靶蛋白的血浆水平。在质量控制和排除50%以上样本中缺失值的蛋白质后，分析了72种蛋白质（数据集EV9）。数据集EV10中列出了CMA组和安慰剂组之间水平差异显著的蛋白质。血浆CD8A、CSF-1、CCL23、FGF-21和肿瘤抑制素-M（OSM）水平仅在CMA组显著降低（图 4A，数据集EV10）；然而，在安慰剂组中未发现炎症相关蛋白血浆水平的显著变化（数据集EV10）。

血浆FGF-21水平在NAFLD患者中升高，是NAFLD的潜在诊断标志物。血浆FGF-21水平与小鼠和人类的高肝脂肪水平呈正相关。血浆CCL23和CD8A水平也与肝脂肪变性有关。我们最近发现血浆CSF-1、OSM和FGF-21水平与肝脂肪变性显著相关。本研究结果与我们以前的研究一致。在排除禁食影响后的1天CMA研究中，FGF-21和CCL23的血浆水平迅速下降，并且FGF-21、CCL23和CSF-1的血浆水平有在1周碳水化合物限制饮食研究中显著降低。

我们评估了血浆中重要蛋白质水平与个体代谢激活剂之间的相关性，发现CSF-1和OSM水平与肉碱和丝氨酸水平呈负相关（图 4B，数据集EV11）。此外，烟酰胺也与CSF-1水平呈负相关（图 4B，数据集EV11）。

我们最终确定了血浆水平发生显著变化的蛋白质与血浆代谢物之间的联系（图 4C，数据集EV12）。FGF-21与C10H14O2、2-羟基辛酸和N2、N2-二甲基鸟苷的甘氨酸结合物相关，与胆红素降解产物、2-哌啶酮和羧乙基GABA呈负相关。

图4. CMA降低血浆炎症蛋白水平。A热图显示CMA组和安慰剂组在第70天与第0天炎症相关蛋白之间显著不同的log2FC改变。星号表示基于Student’s t-检验的统计显著性。P < 0.05。B-E （B） 热图显示了所有炎症相关蛋白的血浆水平与包括丝氨酸、半胱氨酸、肉碱和烟酰胺在内的单个代谢激活剂的血浆水平之间的相关性。星号表示基于Spearman相关分析的统计显著性。P < 0.05; 热图显示了显著不同的炎症相关蛋白（CD8A、CSF-1、CCL23、FGF-21和OSM）与10种最显著相关的血浆代谢物之间的关联，（D）与肠道微生物组中物种的丰度，（E）与口腔微生物组中物种的丰度。星号表示基于Spearman相关分析的统计显著性。P < 0.05;  Cor. Coeff表示相关系数；Log2FC表示log2（折叠变化）。

  5 CMA改变肠道和口腔微生物组

肠道微生物组的改变与NAFLD有关。在我们的研究中，我们收集了粪便和唾液样本，以研究CMA对肠道和口腔微生物群的影响，并揭示了CMA治疗期间宿主和微生物之间的相互作用。

我们首先比较了肠道微生物组中CMA组和安慰剂组第70天与第0天之间物种丰度的差异。我们发现变形杆菌（Neisseria flavescens）、放线菌（Rothia mucilaginosa、Adlercreutzia equilifaciens、Asaccharobacter celatus、Collinsella aerofaciens、青春双歧杆菌和Actinomyces sp ICM47）和厚壁菌（Streptio hominis和Eubacteriumhallii)显著减少。然而，在安慰剂组中，属于厚壁菌门的物种（Firmicutes bacterium CAG 83和Oscillibacter sp 57 20）和普通拟杆菌显著减少（图5A，数据集EV16和EV17）。大量研究表明，与健康对照相比，NAFLD中放线菌和变形菌的丰度在门水平上有所增加。此外，厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加被认为是肥胖相关NAFLD的一个特征，但随后的研究显示出不一致的结果，仍需要进一步研究。

接下来，我们比较了CMA组和安慰剂组在第70天肠道微生物组中的物种丰度。我们发现，在CMA组中，丁酸盐产生菌（Lawsonibacter asaccharolyticus、Eubacterium remulus和Eubacterium siraeum）的丰度显著增加（图 5B，数据集EV16和EV17）。丁酸酸是肠道上皮细胞的首选能量来源，在维持人类健康方面起着至关重要的作用。值得注意的是，与第0天相比，第70天CMA组肠道微生物组中乙醛生产菌Rothia mucilaginosa的丰度显著下调（图 5A）并且在第70天低于安慰剂组（图 5B，数据集EV16和EV17）。

同样，我们比较了口服微生物组中CMA组和安慰剂组在第70天与第0天之间物种丰度的差异。我我们发现在CMA组中，变形杆菌（Cardiobacterium hominis）、拟杆菌（Prevotella maculosa）和放线杆菌（Corynebacterium matruchotii和Actinobaculum sp 口腔分类群183）的丰度显著降低（图5C和EV2，数据集EV18）。我们还发现，在第70天的口腔微生物组中，CMA组与安慰剂组之间放线菌属口腔分类群181的丰度增加，而干燥奈瑟菌的丰度降低（图5D，数据集EV18）。

我们评估了与CMA直接相关的代谢物血浆水平与肠道微生物组中物种丰度的相关性（图5E）和口腔微生物组（图EV2），并发现Faecalibacterium prausnitzii与CMA相关代谢物正相关，即半胱氨酸、半胱氨酸甘氨酸、肌氨酸和N1-甲基肌苷（图 5E，数据集EV17）。我们还发现，血浆半胱氨酸水平与厚壁菌（Roseburia faecis和Oscillibacter sp 57 20）和类杆菌 (Bacteroides ovatus和Bacteroides fragilis) 相关物种的丰度显著正相关。此外，我们观察到N1-甲基-4-吡啶酮-3-甲酰胺和N1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺的血浆水平与Alistipes shahii的丰度显著正相关，与类纤维素杆菌和嗜糖梭状杆菌的丰度呈负相关（图 5E，数据集EV17）。

肠道微生物组的变化通过触发涉及白细胞介素和其他细胞因子的分子与炎症有关。肠道微生物组中Coprococcus eutactus丰度增加，而粪便拟杆菌、Bacteroides dorei、Bacteroides xylanisolnes和Barnessiella intestihominis丰度降低与FGF-21水平相关（图 4D，数据集EV17）。在口腔微生物组中，我们发现Prevotella jejuni和Alloprevotella tannerae的丰度与血浆FGF-21水平显著负相关（图 4E，数据集EV18）。此外，我们发现，与血浆CCL23水平相关的口腔微生物群中，普氏菌和干燥奈瑟菌的丰度增加，Neisseria elongate和副流感嗜血杆菌的丰度减少，其中NASH患者的基因表达水平显著上调（图 4E，数据集EV18）。有趣的是，肠道微生物群中Faecalibacterium prausnitzii和Bacteroides fragilis增加与血浆CD8A水平呈正相关，表明微生物群在调节CD8 T细胞反应中的关键作用（图 4D，数据集EV17）。

尽管口腔和肠道微生物群是不同的，但大量证据表明这些微环境之间存在着密切的关系，这是因为口腔成员通过唾液和摄入的持续流动转移到肠道。因此，我们评估了粪便和唾液微生物组中的物种相关性，发现物种对之间存在显著的正相关，其中只有两对呈负相关（图EV3）。有趣的是，我们发现口腔微生物群中的普氏菌属和肠道微生物群中的拟杆菌属物种的丰度明显受到彼此丰度的影响（图 EV3）。

图EV2. 口腔微生物组物种丰度与血浆代谢物水平（脂质除外）之间的关联。热图显示了血浆代谢物水平（脂质除外）与口腔微生物群中物种丰度之间的相关性。星号表示基于Spearman相关分析的统计显著性。P<0.05；Cor. Coeff：相关系数。

图EV3. 口腔微生物组和肠道微生物组物种丰度之间的关联。热图显示了口腔微生物组和肠道微生物组中物种丰度之间的相关性。星号表示基于Spearman相关分析的统计显著性。P<0.05；Cor. Coeff：相关系数。

  图 5.   CMA改变肠道和口腔微生物组。A-D   线 性回归线散点图和热图显示， CMA 组和安慰剂组在第 70 天和第 0 天肠道微生物组（ A ）中显著不同物种的 log2FC 变化；（ B ） CMA 组和安慰剂组在第 70 天和第 0 天之间的肠道微生物组；（ C ） CMA 组和安慰剂组在第 70 天与第 0 天的口服微生物组；（ D ） CMA 组和安慰剂组在第 70 天和第 0 天之间的口服微生物组。每个点代表一个物种，并根据其对应的门进行着色。星号表示基于配对 Wilcoxon 符号秩检验的统计显著性。 P  < 0.05 。 Log2FC 表示 log2 （折叠变化）。 E   热图显示了血浆代谢物水平（脂质除外）与肠道微生物组中物种丰度之间的相关性。星号表示基于 Spearman 相关分析的统计显著性。 P   < 0.05; Cor. Coeff ：相关系数。   6 临床变量与多组数据的相关性

为了研究改善的临床参数与代谢之间的联系，我们确定了改善的临床变量（如肝脂肪、ALT、AST和尿酸）与各种代谢物之间的显著相关性（图 6A，数据集EV13）。半胱氨酸谷胱甘肽二硫化物、亚氨基二乙酸、4-羟基百菌清和花生四烯酸胆碱水平与肝脂肪显著负相关（图 6A，数据集EV13）。在这些代谢物中，半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物与ALT、AST和尿酸水平显著负相关，表明谷胱甘肽代谢在改善NAFLD患者肝功能中具有关键作用。

我们通过确定改善的临床变量（如肝脂肪、ALT、AST和尿酸）与各种炎症相关蛋白之间的显著相关性，评估改善的临床参数与炎症之间的相关性（图 6B，数据集EV14）。我们观察到肝脏脂肪与血浆CDCP1、CCL23、TNFSF14和FGF-21水平呈正相关；AST水平、血浆CSF-1和CDCP1水平呈正相关；ALT水平和血浆CDCP1、CSF-1、FGF-21水平呈正相关；TNFSF14的尿酸水平和血浆水平呈正相关；OSM和EN-RAGE的肌酐水平和血浆水平呈正相关。此外，我们发现ALT和AST水平与血浆CCL28水平呈负相关，与血浆丝氨酸水平呈显著正相关。

改善的临床变量与关键鉴别微生物种类丰度之间的相关分析表明，肠道微生物群中的普氏菌的丰度与肝脂、AST、ALT和收缩压水平呈正相关（图 6C，数据集EV17）。此外，Prevotella sp CAG 279、Eubacterium sp CAG 38、Bacteroides uniformis和Bacteroides egerthii的丰度与肝脏脂肪呈正相关。相反，Fusicatenibacter saccharivorans和Prevotella sp CAG 279的丰度与肝脏脂肪呈负相关（图 6C，数据集EV17）。我们还发现，双循环瘤胃球菌的丰度与ALT和AST水平显著相关；然而，Alistipes shahii的丰度与ALT和AST水平呈负相关（图 6C，数据集EV17）。值得注意的是，我们发现直肠真杆菌与ALT水平呈显著负相关，粪杆菌与AST水平呈显著负相关；两者都是与健康肠道微生物群相关的众所周知的物种（图 6C，数据集EV16和EV17）。

一些研究报告，口腔微生物群反映了肠道微生物群失调的变化，它可能是肝脏病理学的指标。在我们的研究中，对口腔微生物群的评估表明，Veilonella infantum和Provetolla jejuni的丰度与肝脂肪呈正相关，而Capnocytophaga leadbetteri的丰度与肝脂肪呈负相关；AST水平与Aggretibacter segnis和Haemophilus sp HMCS7 1H05的丰度呈正相关；ALT水平与口腔普氏菌306分类群的丰度呈负相关（图 6D，数据集EV18）。

研究表明，肠道微生物群在尿酸代谢中起着重要作用。本研究中，我们发现肠道微生物群中Bacteroides coprocola和Proteobacteria bacterium CAG 139的丰度以及口腔微生物群中的Neisseria subflava与尿酸水平显著正相关。相比之下，肠道微生物组中Bacteroides ovatus，Butyrivibrio crossotus和Parasutterella excremntihominis的丰度与口腔微生物组中的凝胶溶血酶丰度呈显著负相关（图 6C和D，数据集EV16–EV18）。我们还发现，口腔微生物群中的机会致病菌牙周梭杆菌和索氏卟啉单胞菌的丰度与尿素水平显著正相关（图 EV2A）。有趣的是，肌酐水平与口腔微生物群中的普氏菌和黄色奈瑟菌的丰度增加相关，与Prevotella nigrescens和Veilonella parvula的丰度减少相关（图 6D，数据集EV18）。肠道微生物群中Bacteroides fragilis和Faecalibacterium prausnitzii的丰度与肌酐水平呈负相关（图 6C，数据集EV17）。

图6. 临床数据与组学数据之间的关联。A-D 热图显示了包括肝脂肪、ALT、AST、尿酸和肌酐在内的临床变量的血浆水平与（A）10种最重要代谢物的血浆水平，（B）10种最重要炎症相关蛋白的血浆水平，（C）肠道微生物组中物种的丰度，以及（D）之间的关联口腔微生物群落中物种的丰度。天冬氨酸转氨酶；丙氨酸转氨酶。星号表示基于Spearman相关分析的统计显著性。P < 0.05; Cor. Coeff：相关系数。

  7 综合多组学分析

我们基于临床变量、蛋白质组学、代谢组学和宏基因组学数据生成了一个综合性多组学网络，以显示组学数据内部和之间分析物之间的功能关系。过滤后的网络（边缘FDR<0.05）可在iNet模型上(http://inetmodels.com)查看，这是一个用于多组学数据可视化和数据库的开放式交互式网络平台。我们将统计上改变的代谢物、蛋白质和临床变量与代谢激活剂和肝脂肪的子网络重叠，作为CMA的主要临床变量（图 7A）。此外，我们对过滤网络进行了中心性分析，以确定最中心的分析物。我们确定肉碱是最重要的代谢激活剂。我们还观察到，排名前20位的代谢物主要由脂质结构（鞘磷脂、磷脂酰肌醇/胆碱、二酰甘油和脂肪酸）、γ-谷氨酰苏氨酸和视黄醇（维生素A）组成。对于临床变量，尿酸水平（在CMA组显示为下调）被确定为前5个最相关的临床节点之一。

此外，我们还观察到，Roseburia faecis的丰度（CMA组显著下调）与血浆丝氨酸和肉碱水平显著负相关（图 7B）。基于这些结果，多组学综合网络分析补充并强化了单组学分析结果。我们还观察到丝氨酸和肉碱在代谢激活剂中在改善临床结果方面起着关键作用。

图7. 基于网络分析的组学数据集成。A基于多组学网络分析，介绍了CMA的邻元素，包括丝氨酸、肉碱、烟酰胺和半胱氨酸，以及两个重要的临床变量（肝脂肪和尿酸）。仅突出显示CMA第70天与第0天相比发生显著变化的分析物。B基于多组学网络分析，提出了CMA的一级微生物邻元素和两个重要的临床变量（肝脂肪和尿酸）。完整的网络可以在iNet模型中找到(http://inetmodels.com)。

  8 安全

CMA和安慰剂治疗通常耐受性良好。18名患者（CMA组12名，安慰剂组6名）仅报告轻度至中度不良事件，包括非特异性胃肠道（33%）和肌肉骨骼（20%）症状，所有患者均决定完成研究（数据集EV15）。安慰剂组的三名患者和CMA组的一名患者的胃肠道症状与干预相关，他们的药物剂量减少到每天一次。

图8. CMA治疗后的改善。NAFLD患者CMA治疗后临床变量、血浆代谢组学、炎症蛋白质组学和口腔/肠道微生物组学变化的总结。ALT：丙氨酸转氨酶；天冬氨酸转氨酶；TMAVA：N-三甲基-5-氨基戊酸盐。

讨论

基于数据驱动建模和系统生物学分析，我们发现服用CMA可能会增加肝脏的脂肪氧化，增强细胞中的线粒体功能，并降低氧化应激。为了在临床环境中验证这一假设，我们进行了一项随机、安慰剂对照的2期研究，以调查CMA对NAFLD患者的疗效和安全性。我们观察到NAFLD患者CMA治疗后临床变量、血浆代谢组学、炎症蛋白质组学和口腔/肠道微生物组学的改善（图 8)。我们发现CMA（10%）改善了MRI-PDFF评估的肝脏脂肪含量，并在70天后降低了血清ALT(39%)和AST(30%)水平。我们还观察到CMA降低血浆CD8A、CSF-1、CCL23和OSM水平，如血浆蛋白质组学分析所示，表明CMA减轻了肝脏炎症。CMA组的阳性结果与体重显著减轻无关。

非靶向代谢组学数据的分析证实了CMA治疗的预期生物学结果。血浆N1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺和1-甲基烟酰胺水平升高，表明烟酰胺核苷为线粒体激活提供了充足的底物和NAD+。最近的一项研究表明，这些代谢物有所增加，支持了烟酰胺单核苷酸（另一种NAD+中间体）在糖尿病前期女性骨骼肌中的胰岛素敏化能力。N-乙酰甘氨酸、N-棕榈酰丝氨酸、N-油酰丝氨酸和N-硬脂酰丝氨酸的血浆水平也升高，表明CMA治疗改善了与肝脂肪变性相关的丝氨酸缺乏症。更重要的是，从脱氧卡尼汀、乙酰卡尼汀和丁酰卡尼汀的强劲血浆水平判断，脂肪酸氧化和卡尼汀代谢得到显著促进。此外，在体重减轻调整后，色氨酸代谢物（包括犬尿氨酸、犬尿氨酸和色氨酸甜菜碱）的水平在CMA治疗后显著降低。

出乎意料的是，CMA迅速降低了尿酸和相关代谢物的血浆水平（图 EV4）。尿酸直接或通过激活NLRP3炎性体刺激肝脏脂肪变性。虽然尿酸减少在多大程度上导致肝脂肪变性的消退尚不清楚，但它可能具有叠加效应。CMA如何降低超重和肥胖受试者的血清尿酸水平？最近的一项研究显示，尿酸和1-甲基组氨酸水平与CMA治疗显著降低密切相关。另一种可能的解释是，从丝氨酸中提取的甘氨酸通过刺激尿酸尿降低尿酸水平。鉴于嘌呤代谢水平显著降低，左旋肉碱也可能抑制黄嘌呤氧化酶活性和尿酸生成。需要包括高尿酸血症患者在内的进一步的临床研究，以确定这种效应是否可以推广到治疗高尿酸血症患者。

NAD+和GSH的细胞水平是与代谢状况和死亡风险相关的基本因素。缺失的GSH可以通过服用NAC、丝氨酸和甘氨酸来恢复，这些可以通过丝氨酸的相互转化。CMA的另外两种成分，包括肉碱和NR，刺激脂肪酸从胞浆转移到线粒体，在肝脏疾病中也会耗尽。临床内稳态的全面改善减少了氧化损伤并改善了生物能量学，因此更有可能取得成功的结果。据此，我们最近在短期（14天）2/3期COVID-19临床试验和两个长期（12周）2期阿尔茨海默病 (AD) 和2期帕金森病（PD）临床试验中证明了CMA对不同代谢状况的疗效。值得注意的是，我们在所有短期和长期临床试验中观察到CMA的给药降低了ALT和肌酐水平，并在长期AD和PD2期临床试验中降低了尿酸水平。

微生物组对NAFLD的直接或间接影响仍知之甚少，但许多人类和动物研究已经证实，肠道微生物组通过成分改变、微生物源性代谢物水平的变化和肠道屏障完整性的丧失作为驱动影响因素。尽管患者来源的微生物组组成分析结果不一致，但变形菌门和放线菌门的过度生长以及厚壁菌/拟杆菌比率的增加已被证明是生物失调的常见标志物。在这项研究中，我们综合描述了NAFLD患者服用CMA前后的肠道和口腔微生物组。治疗70天后，我们观察到CMA组中属于变形菌、放线菌和厚壁菌的物种丰度显著减少。此外，细菌代谢的主要终产物是短链脂肪酸，尤其是丁酸酯，可以减轻肠道炎症。在我们的研究中，在CMA组中，众所周知的丁酸生产物种有所增加。我们的结果共同表明，CMA诱导的文献支持有益的改变，例如与Faecalibacterium prausnitzii的丰度呈正相关，Roseburia faecis，或丁酸生产者。除了确定关键物种外，在明确定义的患者队列中定义微生物组和肝脏相关临床参数的独特特征对于发现NAFLD的新生物标记物也很有价值。

需要考虑研究的一些局限性。首先，这项研究被设计为包括45名参与者；然而，由于COVID-19，只有32名受试者参加。此外，样本库中只剩下7名女性受试者（3名来自CMA，4名来自安慰剂组），这妨碍了进行性别特异性分析的可能性。第二，排除患有2型糖尿病或血脂异常或正在服用抗糖尿病药物的患者，从而形成更同质的临床试验组。第三，肝脏脂肪含量和炎症通过基于MRI的方法和血浆炎症蛋白标记物而不是肝脏组织学进行评估。我们的发现证明了对活检证实的非酒精性脂肪性肝炎患者进行临床试验，以阐明CMA对肝损伤和炎症的影响。

这些患者的CMA安全性状况与我们之前的一天校准研究和临床试验的结果一致，仅包括CMA的一个成分。我们目前的研究表明，在NAFLD患者中，CMA是安全且耐受性良好的，并且没有发现重大的安全问题。综上所述，CMA显著降低了10例患者的肝脂肪含量和肝损伤的血清标志物。这些发现表明，通过CMA靶向多种途径是NAFLD潜在的有效治疗策略。

图EV4. CMA降低血浆尿酸水平。在CMA组中，与第0天相比，第70天的尿酸水平显著降低。重点强调了关键代谢反应中代谢物或中间产物的变化：红色和蓝色分别表示CMA组与安慰剂组在第70天显著增加和减少的代谢物。括号中的字母表示亚细胞室：[c]，细胞质；[m]线粒体。箭头和虚线箭头分别链接直接和间接交互。以a结尾的黑色虚线条形图表示被某种代谢物抑制的反应。例如，不对称二甲基精氨酸（ADMA）是一氧化氮合酶（NOS）的有效抑制剂，而对称二甲基精氨酸（SDMA）通过抑制细胞摄取精氨酸来抑制一氧化氮（NO）的产生。CPS1由N-乙酰谷氨酸酯变构调节，由成对的波浪线表示。P5C，1-吡咯啉-5-羧酸盐；GSA，L-谷氨酸5-半醛；CPS1，氨甲酰磷酸合酶1。蓝色箭头表示N-乙酰甘氨酸和脯氨酸从细胞外输入，尿素分泌。