负相互作用决定了合成人类肠道群落中艰难梭菌的生长

编译：微科盟流浪过的梦，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

       了解肠道微生物群对病原体艰难梭菌的定植抗性原理将有助于设计明确的细菌疗法。我们使用合成的人类肠道微生物组研究了区系对艰难梭菌（Clostridioides difficile）的耐药性的生态原理。使用动态计算模型，我们证明艰难梭菌接收传入的负面交互的数量和幅度最大。结果表明，艰难梭菌属于一类独特的物种，在生长和物种丰富度之间表现出强烈的负依赖性。我们确定了抑制的分子机制，包括环境酸化和资源竞争。我们证明部分艰难梭菌通过资源竞争强烈抑制艰难梭菌。增加艰难梭菌的初始密度可以增加其在组装群落中的丰度，但群落环境决定了可实现的最大艰难梭菌丰度。我们的工作表明，可以通过设计具有物种丰富度、环境酸化和资源竞争等机制组合的群落来优化定义的细菌疗法的艰难梭菌抑制潜力。

论文ID

原名：Negative interactions determine Clostridioides difficile growth in synthetic human gut communities 

译名：负相互作用决定了合成人类肠道群落中艰难梭菌的生长

期刊：Molecular Systems Biology

IF：11.429

发表时间：2021.10.25

通讯作者：Ophelia S Venturelli

通讯作者单位：美国威斯康星大学麦迪逊分校

DOI号：10.15252/msb.202110355

实验设计

背景

       与人类肠道微生物群的原生成员相互作用抑制了艰难梭菌、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和大肠杆菌（Escherichia coli）的胃肠道致病菌的能力并引起感染。肠道微生物群定植抗性的重要性在艰难梭菌感染中尤为突出，其中健康供体的粪便微生物群移植（FMT）治疗已证明在消除艰难梭菌症状方面非常有效。因为FMT具有显著的风险，包括耐抗生素微生物的转移、与炎症性肠病发作的潜在关联，以及在极少数情况下的死亡，为了提高活细菌治疗的安全性和可重复性，需要有明确的特征和标准化的细菌治疗方法。然而，设计有效和安全的细菌疗法的一个关键挑战是，存在和缺乏成百上千的潜在生物体的巨大设计空间。提高我们对艰难梭菌入侵群落抗性的生态学原理的认识，可以指导设计最大限度地有效和安全的治疗方法。

       使用鼠类模型在体外或体内抑制艰难梭菌的多个合成群落已被确定。大多数确定的群体是通过筛查由粪便样本分离菌组成的复杂性较低的群体发现的。这些分离株可以随机组合，也可以根据系统发育多样性进行选择。根据资源竞争的预测机制或人类和小鼠肠道微生物组数据的统计分析，更合理地设计了其他艰难梭菌抑制群落，以确定与感染耐药性相关的类群。然而，治疗性合成微生物群落的设计过程往往不利用物种间相互作用或分子机制的信息。更深入地了解抑制艰难梭菌群落的生态学和分子原理可以为治疗联盟的合理设计提供信息。

       在宏观生态学中，研究入侵原理的历史悠久，最近已应用于微生物系统。入侵理论已经确定了决定入侵结果的四个基本过程：扩散、选择、漂移和多样化。生物选择已被证明是入侵结果的关键决定因素，其中更高多样性的群落可以通过减少生态位的可用性和有效利用资源来竞争性地排除入侵者。然而，群落生物多样性并不总是与入侵结果相关，因为其他生物相互作用（例如，抗菌分子的产生）、非生物选择因素（例如，环境pH值、资源可用性）以及扩散、漂移和多样化过程都有助于入侵的结果。例如，在植物病原体的情况下，资源竞争网络的结构比生物多样性更能预测入侵结果。在微生物群落的多次入侵中，发现初始入侵者丰度（即繁殖体压力）的扩散因素是入侵结果的关键决定因素。

       由已知生物组成的合成群落可用于研究入侵结果的驱动因素。合成群落能够控制初始接种量（即有机体的存在/缺失和初始丰度），这可以通过调控来理解影响入侵者生长的生态和分子机制。由实验测量提供的动态计算模型，例如广义模型可用于了解微生物相互作用和预测群落组装。以往对合成群落的建模工作表明，成对的相互作用可以提供群落组装的信息，使低阶群落的表征成为预测多物种群落行为的一种强有力的方法。

       在这项工作中，我们使用一个确定的合成肠道群落，代表天然肠道微生物的系统发育多样性，以研究艰难梭菌入侵成功的决定因素。为了解释微生物间的相互作用、预测群落的聚集和入侵，我们利用数据构建了我们系统的gLV模型，并证明了我们的模型可以准确地预测群落的聚集。基于推断出的gLV相互作用网络，我们证明了负相互作用主导着艰难梭菌的生长，这是我们系统中其他物种所独有的特征。我们发现了多种抑制艰难梭菌生长的机制，包括资源竞争和外部pH值的改变，强调了艰难梭菌的抑制机制因群落环境而异。在我们的模型指导下，我们确定了一个关键的密切相关物种Clostridium hiranonis，它抑制了不同合成群落中艰难梭菌的生长。为了调查影响入侵的生态因素，我们研究了繁殖压力和物种丰富度对艰难梭菌生长的影响。结果表明，艰难梭菌在广泛的群落环境中，丰度与物种丰富度呈现出强烈的反比关系，并且这种关系并非对群落中的所有物种都普遍存在。虽然增加艰难梭菌的繁殖压力可以增加其在群落中的丰度，但每个群落对繁殖压力的敏感性和艰难梭菌的最大饱和丰度由微生物互作网络决定。我们表明微生物群落对艰难梭菌具有广泛的抗性和多种艰难梭菌抑制机制。因此，有关生态和分子机制的信息可以用来设计抑制艰难梭菌的细菌疗法。

结果

1 艰难梭菌与肠道微生物亚群共存

       我们试图使用合成肠道群落了解艰难梭菌入侵的生态原理（图 1A）。作为一个代表性的区域，我们选择了13种常见的肠道微生物组成，这些微生物横跨了人体肠道的主要门类，例如拟杆菌、厚壁菌门、放线菌和而变形菌。该群落以梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）为特色，该物种以前显示可抑制无菌小鼠中艰难梭菌的生长以及一组特征明确的12种不同物种，它们在群落组装方面的相互作用之前已经过研究和计算建模（图 1B）。

图1 使用多样化的合成人类肠道群落研究艰难梭菌入侵的生态原理。 

       A艰难梭菌（CD）侵入程度取决于初始入侵密度、物种丰富度、环境pH值和资源可用性。B基于37个标记基因串联比对的13人合成肠道菌群与艰难梭菌的系统发育树。C实验和建模工作流程示意图。合成菌群在厌氧条件下的微滴平板中培养，并在37°C下培养。每个物种的绝对丰度是通过测量600 nm的细胞密度（OD600）和使用多路16S rRNA测序的群落组成来确定的。利用绝对丰度数据推断广义Lotka-Volterra（gLV）模型的参数。D三个生长周期内单一物种的绝对丰度（OD600）随着时间的推移。数据点表示实验生物学重复。线条表示使用广义Lotka-Volterra整个模型（在单一物种、配对和多物种数据上训练，参见材料和方法）的模拟。细水平灰线表示0.05 OD600的丰度阈值。E三个生长周期中含有艰难梭菌的成对群落的绝对丰度（计算的OD600）随着时间的推移而变化。基于OD600测量，以艰难梭菌与常驻物种的等丰度比接种物种。数据点表示实验数据重复。线条表示使用广义Lotka-Volterra整个模型（在单一物种、配对和多物种数据上训练，参见材料和方法）的模拟。细水平灰线表示0.05 OD600的丰度阈值。粗水平灰线表示艰难梭菌单种最大OD600为0.36。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。数据信息:在D和E中，n =1-3个生物重复（各条件重复信息见附表S4）。 我们使用这个合成肠道群落来研究影响艰难梭菌生长的种间相互作用。为了探索驱动艰难梭菌生长的种间相互作用，我们在厌氧室中的微量滴定板上组装了物种组合，通过600 nm处的吸光度（OD600）测量细胞密度，并通过16S rRNA基因测序在感兴趣的时间点（材料和方法）。每个物种的绝对丰度是通过将其从16S rRNA基因测序得出的相对丰度乘以OD600来计算的。物种绝对丰度的时间序列测量用于推断gLV模型的参数（图 1C）。gLV模型是一个常微分方程的耦合系统，它捕获了改变每个物种生长动态的单一物种和物种间相互作用的增长率和物种内相互作用。gLV模型可用于了解种间相互作用并预测更大系统内所有可能子群落的动态，因此可用于研究艰难梭菌和常驻肠道群落（即除艰难梭菌外的所有物种）。 我们首先研究了艰难梭菌成对群落与每个常驻肠道细菌的时间行为，因为我们假设与常驻肠道细菌之间的互作相比，这些直接互作对艰难梭菌生长的影响最大。 

       为此，每个常驻物种单独生长并与艰难梭菌共培养，特别是流行性核糖 型 027的R20291参考菌株（Exp1，图 1D和E）。可以在附表S1中找到整个工作中所有实验的摘要。由于初始物种比例的变化已被证明会影响群落组装，我们根据OD600值以1:1和1:9的比例接种艰难梭菌与常驻物种的配对（图 1E ，附图 S1）。在26和52小时使用1:20稀释对群落进行传代，以观察3个批次培养生长周期中的群落组装，以了解群落的长期行为。 在这段时间内，艰难梭菌与常驻物种在初始比为1:1的33个条件中有19个（56%）和初始比为1:9的31个条件中有15个（48%）共存(图1E，附图S1)。 尽管在此期间艰难梭菌和拟杆菌在共培养中共存，但与单一物种中的丰度相比，艰难梭菌的丰度有所降低。拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）和卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）对艰难梭菌有较强的抑制作用，使艰难梭菌在最终生长期的承载量分别降低到其单种承载量的17和42%，均一拟杆菌和普通拟杆菌对艰难梭菌的携带能力分别有72和73%的抑制作用 （图1D和E）。拟杆菌已被证明通过对粘膜碳水化合物的竞争机制或二级胆汁酸的毒性来抑制艰难梭菌的生长。由于我们的培养基不含粘蛋白或胆汁酸，观察到的抑制作用表明拟杆菌对艰难梭菌有单独的抑制机制。我们还发现了抑制艰难梭菌的近缘种，包括在系统中与艰难梭菌最接近的Clostridium hiranonis（图1B），它在第一个生长传代中使艰难梭菌的携带能力降低到其单种携带能力的59%（在第二和第三传代中，抑制作用解除）。其次的近亲Eubacterium rectale，将艰难梭菌在第三个生长期的携带能力降低到其单种携带能力的38%（图1D和E）。总之，这些数据表明艰难梭菌可以在多个批量培养周期中与我们群落中的一个物种亚群共存。

2 多物种群落中艰难梭菌的丰度与物种丰富度成反比

       接下来，我们试图了解在一对群落中观察到的艰难梭菌的生长抑制是否在多物种群落中持续，并确定在多物种群落中艰难梭菌生长的生态学原则。为了设计多物种群落进行实验描述，我们基于单物种数据（图 1D）、配对数据（图1E）和之前发布的定植物种对数据创建了我们系统的gLV模型。我们推断出gLV模型的一组初始的参数模型（附S2A“初步模型”，数据集EV1）基于这些数据（表1）并使用该模型预测48小时内所有可能的2-13个成员居民群落（8178个群落，附图S2B）中艰难梭菌的丰度。利用初步模型的预测，我们选择了94个2-13个成员群落，这些群落的艰难梭菌丰度超出了预测的艰难梭菌丰度的全部范围，并且在不同初始物种丰富度（定植群落的物种数量）中具有近似相等的物种代表性。 我们通过实验将这些群落与所有物种（包括艰难梭菌）的初始丰度相同，并在48小时后测量了群落的组成（Exp2）。 我们添加了艰难梭菌在0小时到区域调查在扰动的低密度环境中的种间相互作用，该环境可以模拟抗生素治疗等干扰。我们在48小时时测量了群落组成，因为初步模型预测此时大多数群落已达到稳定阶段。在此单批培养周期（短期动态）后测量的群落组成可能与多次稀释周期（长期动态）后的群落组成不同。然而，在单个批次培养周期结束时测量群落组成使我们能够研究影响艰难梭菌的生态和分子因素在广泛的群落环境中生长，这些环境因物种的存在/不存在和物种丰富度水平而异。 我们首先研究了初始物种丰富度与艰难梭菌丰度之间的关系。生物多样性-可入侵性假说认为，物种丰富的群落占有的生态位比例较高，这降低了入侵物种的生态位可用性，从而相对于物种丰富度低的群落增强了对入侵的抵抗力。与生态学理论一致，不同群落中艰难梭菌的平均丰度随着物种丰富度的增加而降低（图 2A）。无论在初始时间点还是最终时间点，物种丰富度与艰难梭菌丰度之间的负相关均保持不变（图 2A ，附图S3A）。值得注意的是，艰难梭菌没有在任何丰富度超过8的群落中建立。整个群落（13名常驻成员）在48小时前将艰难梭菌排除在群落之外。整个群落的这种抗性不仅在核糖型027菌株中观察到，而且在艰难梭菌感染（CDI）诊断后72小时内源自患者的三个单独的艰难梭菌临床分离株中也观察到（Exp6，附图S3B，材料和方法）。 表1 用于gLV模型的数据。

图2 艰难梭菌的生长随群落丰富度的增加而降低。 

       A 94个亚群落48h艰难梭菌（CD）绝对丰度（计算OD600）与初始物种丰度的关系。数据点表示生物复制的平均值。直线表示中值，框边表示第一和第三个四分位数，须表示最小和最大。异常值用钻石表示。计算得到的OD600是16S相对丰度与群落OD600的乘积。B 广义Lotka-Volterra模型（gLV）整个模型的种间相互作用系数热图。C 绝对丰度（计算的OD600）与gLV整个模型在24个保留群落中预测的绝对丰度的散点图（Pearson r= 0.84，P= 6*10-52）。误差棒代表生物重复平均值的一个SD。数据点颜色表示物种身份。灰线表示y=x，或100%的预测准确度。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。D gLV整个模型中每个物种的传入种间相互作用的箱式图。星星代表艰难梭菌和每个常驻物种之间的统计显著性：*P< 0.05，**P<0.01，***P<0.001根据未配对t检验。线代表中位数，框边代表第一和第三四分位数，小棒末端和首端代表最小值和最大值。异常值用菱形表示。E 48小时时每个物种绝对丰度的子图，作为gLV整个模型模拟的2-13个物种的所有16370个可能子群落中的初始物种丰富度的函数（灰色数据点）和204个实验测量的子群落（生物的平均值）重复，彩色数据点。圆圈代表整个模型训练数据集中包含的子群落。三角形代表未包含在整个模型训练数据集中子群落。线条显示拟合模拟数据（灰色虚线）和实验数据（实线）的指数衰减模型（y =  ae -bx ）。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。F从指数衰减拟合到E中的实验数据的衰减常数b的条形图。彩色数据点是来自五个模型的最佳拟合参数，其中每个模型都在由4/5的实验数据点组成的随机采样数据子集上进行训练。灰色条表示来自对所有数据训练的模型的最佳拟合参数值。我们想了解物种丰富度和艰难梭菌丰度之间的强反比关系是否可以通过其与群落的相互作用来阐述。 为了研究这个问题，我们使用单一物种、成对和多物种联合体的测量（表1）推断出一组新的gLV模型参数（图 2B，数据集EV2），并发现整个模型具有很高的优点拟合训练数据（图EV1A，Pearson r =0.89，P =0.0）。为了验证整个模型的预测能力，我们从涵盖广泛物种丰富度和梭状芽孢杆菌丰度（图 EV1B），发现该模型以高精度预测了保留数据集的群落组成（图2C，Pearsonr=0.84，P=6*10-52）。相比之下，在单一物种和配对上训练的初步模型对这24个多物种群落的预测要少得多，这表明该模型需要来自多物种实验的信息（图 EV1C，Pearson r=0.52，P=1*10-14）。

       我们使用Metropolis-Hastings马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）（材料和方法）进行了参数不确定性分析，以确定参数是否受到数据的充分约束。82%参数的变异系数（CV）<0.05（CV范围为0.006至0.06），表明参数已充分受数据约束（图 EV1D）。  

图EV1广义Lotka-Volterra模型的参数不确定性和预测能力分析。

       值得注意的是，在种间相互作用网络（图2B）中，所有物种都抑制了艰难梭菌。艰难梭菌对群落中的大多数物种产生了积极影响，这与负面传入相互作用相结合，对艰难梭菌的生长产生了多个负反馈循环。增加物种丰富度会增加对艰难梭菌生长的负反馈循环的数量，从而深入了解艰难梭菌丰度和物种丰富度之间的负相关关系。艰难梭菌的独特之处在于它在系统中传入的负面相互作用的数量和幅度之大（图2D）。因此，我们假设其他物种可能不会在群落丰富度和丰富度之间表现出同样强烈的反比关系。例如，具有许多积极传入相互作用的物种可能在包含促进生长的物种的高丰度群落中具有生长效益。 我们分析了有和没有艰难梭菌的多物种群落中每个物种的丰度和丰富度之间的关系（Exp2和Exp3，图 2E）。此外，我们使用整个模型来模拟所有可能群落（总共16383个群落）中每个物种的丰度，以补充我们的实验数据（图 2E）。为了量化每个物种的丰度和丰富度之间的关系，我们将指数衰减模型（y=ae-bx）拟合到数据（实线）和模拟（灰色虚线）。实验数据拟合的衰减常数表明艰难梭菌、平氏梭菌和普氏菌丰度和物种丰富度之间有很强的负相关关系（b >0.2，图2F）。然而，Blautia hydrotrophica、B. vulgatus、Desulfovibrio piger和Eggerthella lenta显示出丰度和丰富度之间没有关系（b<0.05）。拟合模拟数据的衰减常数（图 EV2A ）与拟合实验数据的衰减常数（图 2F）一致。例如，在模型中，艰难梭菌和C.hiranonis强烈依赖于丰富度（b>0.2），而大肠杆菌（E. lenta）和B.hydrotrophica显示没有关系（b<0.05）。衰减常数与物种增长率无关，因此丰度和丰富度之间的关系不能用物种是快速生长还是缓慢生长来解释（图 EV2B）。C.hiranonis还具有大量负面传入相互作用，这表明C.hiranonis对丰富度的依赖机制可能与艰难梭菌相似（图 2D ）。总体而言，我们的数据和模型分析表明，艰难梭菌的丰度与物种丰富度呈强烈的反比关系，这种关系并非对所有物种都普遍。

 图EV2 分析模拟和测量的衰减常数量化物种丰富度和丰度之间的关系。

3 增加繁殖体压力会增加合成群落中艰难梭菌的丰度

       繁殖体压力假说表明，增加繁殖体压力或入侵者的数量（其传播频率和丰度的乘积）会增加成功入侵的机会。 为了表征我们系统中繁殖体压力的影响，我们接下来研究了艰难梭菌繁殖压力与其在48小时的丰度之间的关系。在我们的系统中，我们将艰难梭菌添加到系统中的单个时间点，因艰难梭菌的繁殖体压力仅受艰难梭菌初始丰度的影响。在本实验中，我们将繁殖体压力定义为艰难梭菌的初始分数。我们分析的初始分数之间的关系的艰难梭菌和最终丰度艰难梭菌在2-13构件多物种群落（EXP2，图 3A灰色数据点）除了15个3-4群落的测量（EXP4, 附表S2）。我们关注3-4个成员群落，因为在这个狭窄的丰富度范围内的群落在48小时内具有广泛的艰难梭菌丰度（图 2A）。我们选择了具有广泛预测的艰难梭菌丰度的15个群落。我们以多种物种比例接种这些群落，并随时间测量组成（图3A中的彩色数据点和EV3A）。与理论一致，艰难梭菌的最终丰度与群落中艰难梭菌的初始分数相关（图3A，Pearson r =0.75 p=1*10-23）。在所有15个3-4成员群落中，与艰难梭菌初始分数低的群落相比，艰难梭菌在48小时的丰度在接种高初始艰难梭菌分数（大约占群落总生物量的65%）的群落中更高。艰难梭菌（约占总群落生物量的10%）（图 3A）。这表明增加繁殖体压力艰难梭菌可以在48小时增加其在群落中的丰度。

 图3 初始密度对艰难梭菌生长的影响。

       A群落中48小时艰难梭菌（CD）绝对丰度（计算OD600）的散点图，作为艰难梭菌初始分数的函数。艰难梭菌在0小时被引入群落。灰色数据点是图2A中测量的2-13个成员群落 。彩色数据点是在两个初始条件下测量的3-4个菌群群落：低密度（约占总群落OD600的10%）或高密度（约占总群落OD600的65%）。灰线表示线性回归（y =0.25x-0.01，Pearson r= 0.75，P =1*10−23）。透明数据点表示生物学重复，并通过透明线连接到相应的平均值。插图：在低密度或高密度入侵的群落中，48小时内艰难梭菌的丰度。灰色y = x线表示丰度没有变化。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。B艰难梭菌在48小时时的绝对丰度（计算OD600）作为不同合成群落中艰难梭菌初始分数的函数。艰难梭菌在0小时添加到群落。数据点表示生物学重复。线条表示希尔函数拟合（材料和方法）。图例中显示了0小时的常驻物种丰富度（rh）。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。C艰难梭菌的初始分数对应于基于B中拟合的希尔函数推断的半最大丰度（EC50），用于具有足够测量值来约束函数参数的群落子集。红色圆圈表示0小时的常驻物种丰富度。D与0%初始艰难梭菌条件相比，具有5-60%初始艰难梭菌的整个群落中物种绝对丰度的倍数变化（生物重复的平均值，n= 3）的热图。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。星代表统计显著性：*P < 0.05，**P< 0.01，***P<0.001根据未配对t检验。

       对于一组3-4个成员群落，我们进行了类似的实验，但增加了测试初始分数的数量，以更好地解决48小时繁殖体压力与丰度之间的关系 （Exp5，图 3B）。增加艰难梭菌的繁殖压力会在给定范围内的组装群落中产生更高的艰难梭菌丰度。然而，对于超过阈值的高初始分数，艰难梭菌的丰度接近类似的最大丰度。群落中饱和状态下艰难梭菌的丰度在不同亚群落中有所不同，表明微生物相互作用网络决定了艰难梭菌的最大丰度。我们将繁殖体压力敏感性定义为导致48小时入侵者半数最大丰度的初始入侵者分数，类似于剂量反应曲线的EC50（图3C）。群落对艰难梭菌的初始分数表现出不同的敏感性，EC50范围在0.1-0.2之间。群落R（附表S2）对艰难梭菌的入侵最为敏感。因此，虽然增加艰难梭菌的繁殖体压力可以将其丰度增加到最大阈值，但对繁殖体压力的敏感性和艰难梭菌的最大饱及丰度由微生物相互作用网络决定。

图EV3 随着时间的推移，艰难梭菌丰度对繁殖体压力的依赖性。

       在实验和模拟中，总初始OD600保持不变，导致每个物种的初始OD600随着丰富度的增加而降低（材料和方法）。 因此，我们认为艰难梭菌在高丰度群落中的低丰度（图 2A）可能是初始丰度较低的结果。为了测试这种可能性，我们以一系列初始分数将艰难梭菌引入整个群落（丰富度为13）。我们观察到，当繁殖压力增加时，艰难梭菌在整个群落中的丰度增加，尽管最大丰度低于大多数3-4个成员群落（图 3B）。因此，虽然增加繁殖体压力可以部分克服物种丰富度在剂量响应的线性范围内对艰难梭菌生长的抑制作用，但高丰富度仍然降低了最大饱和艰难梭菌丰度。 在本实验中，艰难梭菌丰度在48小时随繁殖体压力的变化或许是一种短暂效应，这可能是由于离聚集群落的长期组成或持续的历史依赖行为。我们的3-4个成员群落的时间序列数据表明，在大多数群落中，艰难梭菌的丰度在48小时时接近饱和（图 3A和EV3A）。这表明接种高密度或低密度艰难梭菌的群落在这些群落中产生了明显的长期丰度。相比之下，我们的模型（材料和方法）的稳定性分析发现所有亚群落都是单稳态的，因此没有长期历史依赖性。例如，我们对图3B中六个群落的模型模拟预测，艰难梭菌丰度对繁殖体压力的强依赖性是暂时的，因为早期（12小时）的依赖性在更长的时间尺度上减少并收敛到最终丰度独立于繁殖压力，因为这些群落是单稳态的（图 EV3B-D）。因此，gLV模型可能缺少关于这些群落的长期历史依赖行为的信息。 当增加图3B中6个常驻群落中艰难梭菌的繁殖体压力时，48小时时常驻群落的组成随初始艰难梭菌丰度而变化。为了量化这种变化，我们计算了在存在和不存在艰难梭菌的情况下居民群落组成之间的归一化欧几里德距离（材料和方法） 。在我们的实验数据中，欧几里德距离与群落中艰难梭菌的丰度相关（附图S4A，Pearson's r =0.61，P=6*10−13）以及所有1-13个成员群落在接种后6小时被艰难梭菌入侵的模拟（附图S4B，Pearson's r=0.58，P =0.0）。

       这些数据表明，一般而言，艰难梭菌丰度越高，对群落组成的影响越大。然而，对于固定的艰难梭菌初始丰度，欧几里得距离的无法解释的变化表明，种间相互作用也会影响群落因艰难梭菌的存在而改变的程度。 在整个群落中，我们观察到艰难梭菌较高的群落中，D. piger和B. hydrogenotrophica的丰度显著增加，而普通梭菌的丰度显著降低 （图3D）。这些趋势在艰难梭菌核型027菌株的整个群落以及单个临床艰难梭菌分离株的整个群落都可以观察到（图EV4A）。从模型（图2B）可以看出，艰难梭菌与B. hydrogenotrophica之间存在正交互作用，这表明增加初始艰难梭菌丰度直接促进了B. hydrogenotrophica的生长。但影响D. piger和B. vulgatus种间相互作用系数与观测到的趋势不一致。这些数据表明，gLV模型可能无法捕捉到高初始艰难梭菌密度对所有肠道物种生长的影响。而在较高的初始密度下，艰难梭菌显著增加了整个群落中B. hydrogenotrophica的丰度（图3D）。3个成员群落F、G和N的氢营养物质丰度没有受到影响（图EV4B），这表明艰难梭菌对特定物种的影响除了取决于初始丰度之外，还取决于群落环境。我们注意到，B. hydrogenotrophic和D. piger作为氢消耗者具有相似的代谢生态位，这表明艰难梭菌可以通过共享的机制促进它们的生长。

 图EV4 艰难梭菌对群落的物种丰度的影响。

4 合成群落的一个子集通过酸化环境抑制艰难梭菌

       虽然群落实验揭示了物种丰富度和繁殖压力对多物种群落中艰难梭菌建立的重要性，但数据中仍然存在无法解释的差异。例如，具有相同丰度的群落侵入具有相同丰度的艰难梭菌，在48小时时显示出广泛的艰难梭菌丰度（图 2A）。由于在之前的研究中已经证明环境pH值会影响艰难梭菌的生长,我们接下来研究环境的生物改造如何改变艰难梭菌的生长。为此，我们将15个3-4成员群落的集合增长了6小时，然后以低或高初始密度的艰难梭菌入侵，让群落有时间改变环境。在入侵时，我们测量了菌群群落的组成和培养基的pH值（Exp6，图4A）。为了了解入侵时间对艰难梭菌生长的作用，我们比较了在6小时入侵的这些群落中的艰难梭菌丰度与在0小时入侵的群落（Exp5、图4B）。艰难梭菌在多个群落中建立的能力在很大程度上取决于引入的时间（图 4B)，表明在这6小时内对环境的生物改造改变了艰难梭菌的生长能力。  

图4 环境因素对艰难梭菌入侵的影响。 

       A以低密度（“LD”）或高密度（“HD”）入侵艰难梭菌（CD）的群落组成的条形图。颜色表示物种身份。哈希表示入侵时间。误差棒代表生物重复平均值的一个SD。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。B在0小时与6小时低密度（大约10%群落OD600）引入时，艰难梭菌在48小时时在群落中的绝对丰度（计算的OD600）散点图。透明数据点表示生物学重复，并通过透明线连接到相应的平均值。线表示对应于增长没有变化的x=y线。颜色表示群落，见D中的图例。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。C艰难梭菌在48小时作为初始环境pH的函数OD600。数据点表示生物学重复，线表示平均值。D入侵群落中艰难梭菌在48小时的绝对丰度（计算的OD600）散点图作为入侵时环境pH的函数。15个3-4群落被（▲）高密度C入侵。艰难梭菌（大约33%群落OD600）或（●）低密度艰难梭菌（大约10%群落OD600）在6小时。颜色表示群落。垂直灰线表示新鲜培养基的pH值。插图：6小时时环境pH值和总群落OD600的散点图。透明数据点表示生物学重复，并通过透明线连接到相应的平均值。垂直灰线表示新鲜培养基的环境pH值。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。E、F艰难梭菌倍数变化的柱状图，其中pH调节至相对于生长的新鲜培养基（F）的pH值在灭菌上清液（E）或上清液生长。艰难梭菌在新鲜培养基中。将生长量化为0至20小时 OD600的曲线下面积（AUC）。数据点表示生物学重复，条形表示平均值，误差条表示与生物学重复平均值的一个SD。红线显示了在6小时（顶部）收集的群落上清液的pH值和经过pH调节的上清液（底部）。水平灰线表示与新鲜培养基相比生长没有变化。

       在前6小时内降低培养基pH值的群落具有较低的艰难梭菌丰度（图4D）。然而，入侵时具有较低pH值的群落也具有较高的总生物量（图4D）。由于这些变量与酸性发酵终产物的生长耦合生产有关，因此pH值或资源竞争可能是抑制艰难梭菌的原因。因为艰难梭菌丰度随着环境pH值而增加（图4C），我们假设生长抑制是由于培养基pH值的变化。为了验证我们的假设，我们培养了一组群落，并在6小时后收集并消毒群落上清液。艰难梭菌存在于无菌上清液（图4E）或改良的无菌上清液中，其中将pH值调节至新鲜培养基的pH值以消除pH值对生长的影响（图4F）。我们将艰难梭菌的生长量化为20小时内艰难梭菌OD600的曲线下面积(AUC)，它受生长速率和承载能力的影响。H、I和K群落对共培养和上清中艰难梭菌均有较强的抑制作用，将上清pH提高到新鲜培养基的pH值，可消除艰难梭菌的抑制作用（图4F），表明pH是这些群落上清中艰难梭菌抑制作用的驱动因素。这些群落中的每一个都含有丰富的拟杆菌属物种（附表S2），其发酵终产物使培养基酸化，表明拟杆菌属物种负责通过pH调节进行抑制。我们观察到CommI在具有不同缓冲能力和可用底物的几种其他培养基中对艰难梭菌的pH依赖性抑制，表明该结果不是我们的培养基所特有的（附图S5）。

       与这种pH依赖性抑制相反，群落O（CommO）的无菌上清液由C.hiranonis、Collin-sella aerofaciens和B. hydrogenotrophica组成，其pH值与新鲜培养基的pH值没有显著差异，无论pH值如何调整，它都能抑制艰难梭菌（图4E和F）。这意味着该群落通过不依赖pH值的机制抑制艰难梭菌。由C. hiranonis、D. piger和E. lenta组成的E群落（CommE）的无菌上清液对艰难梭菌没有抑制作用，其独特的pH值高于新鲜培养基（图4E）。然而，当CommE无菌上清液的pH值降至新鲜培养基的pH值时，艰难梭菌的生长受到抑制（图4F）。这表明无菌上清液通过提高环境pH值来促进艰难梭菌的生长，而群落通过异于pH值的独立机制抑制艰难梭菌的生长。CommE的生长抑制作用仅在培养基的pH升高被消除时才显现出来，这表明影响同一群落内艰难梭菌生长的不同机制之间存在相互作用。

       我们探索了一个物种对环境pH值的敏感性是否与其对物种丰富度的依赖相关，如图2E所示 。我们测量了每个物种的AUC作为单一物种初始环境pH值的函数，并确定了拟合这些数据的线的斜率（图EV5A），代表物种生长对外部pH值的敏感性。结果表明，对物种丰富度的敏感性和对pH值的敏感性之间没有显著相关性（图EV5C）。因此，虽然培养基的酸化是我们系统中群落抑制艰难梭菌的一种机制，但我们的结果表明，艰难梭菌也存在与pH无关的机制丰度和物种丰富度之间存在强烈的反比关系。

图EV5 单一培养中的常驻肠道物种pH敏感性。

5 C. hiranonis通过与pH无关的机制抑制艰难梭菌

       我们注意到表现出pH非依赖性生长抑制的两个群落（CommE和CommO）包含C. hiranonis，它在我们的整个模型中与艰难梭菌具有很强的双向负相互作用 （图2B）。我们的模型预测，艰难梭菌在48小时的丰度随着CommE、CommO和C.difficile-C中C.hiranonis初始丰度的增加而降低（图5A）。我们通过实验证实了这一预测（Exp7，图 5B ）。艰难梭菌甚至被低初始量的C. hiranonis抑制，在CommE（下降> 4倍）和CommO（下降>1.5倍） （图5B） 中，0到10%的初始C.hiranonis的生长显著下降。CommE和CommO对艰难梭菌的抑制作用明显高于C. hiranonis-C. difficile（图5B）。该结果表明群落中的其他物种增强了C. hiranonis对艰难梭菌生长的抑制作用。

 图5 C. hiranonis抑制艰难梭菌的生长。 

        A使用广义Lotka-Volterra（gLV）整个模型作为不同群落中 C. hiranonis （CH）初始分数的函数的模拟艰难梭菌（CD）绝对丰度（OD600）在48小时的线图。插图：gLV整个模型中48小时模拟C.hiranonis绝对丰度（OD600）的线图，作为群落C. hiranonis初始分数的函数。B艰难梭菌在48小时绝对丰度（计算OD600）作为初始分数的函数。插图：群落中48小时C. hiranonis绝对丰度（计算OD600）的线图，作为群落C. hiranonis初始分数的函数。数据点表示生物学重复，线表示平均值。计算的OD600是16S相对丰度和群落OD600的乘积。C艰难梭菌和C.hiranonis单种在生长20小时后代谢物利用和分泌的二分网络。显示了与培养基对照相比变化至少两倍的代谢物。边缘宽度与代谢物折叠变化成正比。D与C.hiranonis无菌上清液相比，新鲜培养基中七种代谢物浓度的散点图。E与新鲜培养基中艰难梭菌的生长相比，灭菌上清液中艰难梭菌生长倍数变化的条形图。生长被量化为0至20小时OD600的曲线下面积（AUC）。数据点表示生物学重复，条形表示平均值。培养基加标条件是添加1X新鲜培养基浓缩在小体积中。根据未配对的t检验，星号代表条件和未修饰的C. hiranonis上清液之间的统计显著性：*P <0.05，**P <0.01，***P<0.001，并且ns=不显著。所有重要条件的条形都带有紫色阴影。  

       我们接下来考虑了C. hiranonis抑制艰难梭菌的机制。已知C. hiranonis将初级胆汁酸转化为抑制艰难梭菌的次级胆汁酸。然而，由于我们的培养基中没有初级胆汁酸，我们转向了其他可能的抑制机制。艰难梭菌被CommE和CommO的无菌上清液抑制（图4E，附图 S6)，表明抑制作用不需要细胞直接接触。这些机制可能包括抗生素或有毒代谢副产物的产生、pH值的改变或对资源的竞争。C. hiranonis已被证明在我们的培养基条件下消耗广泛的代谢物（比我们系统中的任何其他物种都多），并且已知含有增稠氨基酸发酵的基因，这是艰难梭菌中能量产生的主要过程。因此，C. hiranonis可以通过利用多种资源来抑制艰难梭菌消耗。我们使用液相色谱-质谱法（LC-MS）对20小时收集的C.hiranonis和艰难梭菌上清液进行了外代谢组学检测，发现这两个物种在我们的培养基中利用了一组重叠的代谢物（图5C）。我们确定了两种上清液中显著减少（>2倍）的七种代谢物：乙酰鸟氨酸、葡萄糖、谷氨酰胺、脯氨酸、丙酮酸、丝氨酸和苏氨酸。

        我们设计了一个实验，以了解艰难梭菌和C.hiranonis在共培养中对这些代谢物的潜在资源竞争。首先，我们使用LC-MS测定了新鲜培养基和20小时C. hiranonis上清液中这些代谢物的浓度，以及七种代谢物中每一种的已知浓度的标准曲线（图5D）。然后，我们调整了C. hiranonis无菌上清液中七种代谢物中每一种的浓度，以匹配新鲜培养基中的浓度。我们培养了艰难梭菌在这些经过修饰的上清液中，以及经过修饰以调整六种或七种代谢物的所有组合的上清液。我们将艰难梭菌的生长量化为48小时内艰难梭菌OD600的AUC（图5E）。与新鲜培养基相比，艰难梭菌在C. hiranonis上清液中的生长倍数变化为23%，显示出强烈的抑制作用，这与共培养中观察到的抑制作用（图5B）和我们的相互作用网络（图2B）一致。艰难梭菌与未修饰的上清液（新鲜培养基生长的23%）相比，葡萄糖调整的上清液（新鲜培养基生长的41%）的生长明显更好，但其他六种单独代谢物调整中的任何一种都没有显著差异。补充上清液中的所有七种代谢物显著增加了艰难梭菌的生长水平，与添加葡萄糖的水平相似（新鲜培养基生长的45%）。有趣的是，七种化合物上清液和六种化合物上清液中不包括葡萄糖的艰难梭菌生长没有显著差异。因此，除葡萄糖外的代谢物单独添加时对艰难梭菌的生长没有显著影响，但它们作为一组添加时对艰难梭菌生长有显著影响。艰难梭菌在所有六种化合物上清中生长相同的事实表明，在这组化合物中存在代谢冗余。综上所述，补充7种代谢物均可部分缓解观察到的C. hiranonis-C的艰难抑制。这表明艰难梭菌在C.hiranonis上清液中被抑制，是因为这些代谢物的某些亚群浓度较低被C.hiranonis消耗。我们的数据也支持这一现象，这些代谢物也被艰难梭菌在单一物种中消耗。然而，我们不能排除添加这些代谢物可以弥补抑制艰难梭菌的不同化合物的作用。

       由于这些化合物的恢复仅局部缓解了C. hiranonis的抑制作用，我们想知道其他抑制作用的机制。除了上述七种资源之外，我们还考虑了C.hiranonis和艰难梭菌竞争其他资源的可能性。为了测试其他化合物的恢复是否可以进一步缓解抑制作用，我们将浓缩培养基补充到C. hiranonis上清液中（10X浓缩ABB以1:10稀释加入C. hiranonis上清液）。补充浓缩培养基后，C. hiranonis完全消耗的化合物是其原始培养基浓度的1倍，而C. hiranonis未利用的化合物是其原始培养基浓度的2倍。因此，如果只有资源竞争才能抑制艰难梭菌的生长，那么在补充条件下艰难梭菌的生长将被完全提升到在新鲜培养基中生长的水平。然而，在添加的上清液中，艰难梭菌在新鲜培养基中生长率为36%（图 5E）。因此，这些数据表明C. hiranonis条件培养基的抑制作用是由于资源竞争和独立未知抑制机制的结合。此外，C. hiranonis的pH值上清液与新鲜培养基没有显著差异，排除了pH作为潜在机制。为了测试蛋白质是否对艰难梭菌抑制负责，我们通过加热变性（95°C 1小时）或用广谱蛋白酶蛋白酶K消化来灭活C. hiranonis上清液中的蛋白质。与未处理对照相比，这两种处理中艰难梭菌的生长有显著差异，这表明C. hiranonis的抑制不是由于蛋白质抗生素或毒素。总之，我们的结果表明C. hiranonis通过资源竞争部分抑制了艰难梭菌，但也通过蛋白质独立的机制抑制艰难梭菌。

讨论

       我们将自下而上构建微生物群落与动态计算模型相结合，研究微生物相互作用对艰难梭菌生长的影响。我们的结果表明微生物群落对艰难梭菌入侵具有广泛的抵抗力。作为群落背景的这种入侵结果的变异表明，生物的选择是一个主要的设计因素，可以优化治疗艰难梭菌感染，并激发在设计过程中利用生态和分子相互作用的信息。以前设计艰难梭菌抑制限定菌群的努力使用自上而下的选择，通过单独减少培养粪便样本的复杂性或结合筛选抗生素耐药表型。这些方法依赖于尝试和错误的方法来发现抑制菌群，而不是测试合理设计的抑制菌群。有些组合是通过采用自下而上的方法组合选定的物种而合理设计的，但我们注意到这些选择使用单一的设计标准。我们确定了艰难梭菌入侵的原则，可以作为未来研究设计抑制菌群的多重标准。先前的工作已经证明了胆汁酸转化和粘膜糖竞争抑制艰难梭菌的机制。我们的结果表明，高度丰富的菌群、使环境酸化的菌群以及竞争艰难梭菌使用的有限资源的菌群是抑制艰难梭菌的有利候选者。总之，这些结果表明可以组合多种靶标表型来设计最佳定义的细菌疗法来抑制艰难梭  菌。

       为了收集多种物种群落的数据来丰富我们的模型，我们采用单批培养的方式培养群落。该实验设计为破译微生物相互作用提供了信息，因为该系统在第一批培养周期中离稳态最远，因此具有丰富的动态行为。尽管我们没有使用多个稀释周期来表征多物种群落的长期动态，但我们能够在更短的时间范围内对艰难梭菌与合成肠道群落的相互作用得出许多见解。值得注意的是，艰难梭菌是唯一被所有其他菌群成员抑制的物种。艰难梭菌感染通过引起腹泻（即减少肠道细菌的停留时间）、诱发肠道炎症和改变资源景观来破坏肠道细菌的环境，这表明肠道细菌可能已经进化到对肠道产生负面影响艰难梭菌的生长以促进它们在肠道中的健康。

       研究表明，CDI患者的肠道菌群的丰富度明显低于健康对照组，但这种关联并不能区分CDI是否会降低肠道菌群的丰富度，还是低丰富度菌群更容易受到CDI的影响。数据中丰富度和艰难梭菌丰度之间的显著趋势（图 2A）表明，低丰富度微生物组更容易受到CDI的影响。支持这一假设的是，低丰富度群落对入侵的敏感性已在其他微生物系统中得到证实。这表明抗生素治疗导致肠道微生物群丰富度的减少可能是抗生素使用后发生的CDI风险增加的基础。此外，FMTs的有效性可能部分归因于粪便样本的高丰富性，据估计有超过100个物种。

       基于我们的研究，高丰富度的菌群是抑制艰难梭菌定植最有效的细菌治疗方法。高丰富度细菌疗法的可扩展制造是具有挑战性的，这表明需要新的技术来可靠地维持所有物种的培养群落，而不是单一物种的标准培养。然而，如果高丰富度群落的制造仍然是一个挑战，我们的结果表明，可以设计低丰富度抑制群落。在我们的系统中，所有高丰富度群落（8种或8种以上）均不包括艰难梭菌，而低丰富度群落则不包括艰难梭菌。例如，3个成员的菌落像整个群落一样有效地排除了艰难梭菌（图 3B）。本文证实了这些结果，在体外和小鼠模型中，5-7个成员的低丰富度群落被证明可以抑制艰难梭菌。

       我们证明了群落中不同物种的物种丰度和丰富度之间的关系存在显著差异（图 2E和F）。这些趋势不能用物种增长率（图 EV2B）或对pH的敏感性（图 EV5C）来解释。此外，物种间相互作用网络的格局也不能完全解释物种丰富度敏感性的变化。在我们的系统中，B. hydrotrophica和E. lenta的丰度不随丰度而变化。值得注意的是，这些物种的独特之处在于它们作为醋酸根分别利用氢、二氧化碳和精氨酸的能力。因此，正交生态位可能是丰度对丰度敏感性较低的一种机制。此外，物种生态位对竞争的可塑性可能影响物种丰度与丰富度之间的关系。未来的工作将研究这些潜在的机制，决定在更大的群落和体内的丰度和丰富度之间的关系。

       已发现拟杆菌在不同环境中抑制和促进艰难梭菌的生长，但在我们的系统中所有拟杆菌属均抑制艰难梭菌。我们没有观察到C. scindens对艰难梭菌的强烈抑制作用，这在之前已被证明是通过产生抑制艰难梭菌萌发的次级胆汁酸而发生的，大概是由于我们的培养基中没有胆汁酸。相反，在我们的系统中，艰难梭菌的近亲，C. hiranonis是艰难梭菌丰度最强的抑制剂。添加艰难梭菌和C. hiranonis共同利用的代谢物之一葡萄糖，部分挽救了艰难梭菌在C. hiranonis消耗培养基中的生长（图 5E），表明葡萄糖竞争可能是艰难梭菌抑制的机制之一。抑制菌群的设计可以最大化菌群成员与艰难梭菌之间对碳水化合物（如葡萄糖）的资源竞争。因为估计有20%的碳水化合物（如葡萄糖）无法被宿主吸收，并且存在于结肠中，所以碳水化合物竞争可能与结肠环境有关。

       我们注意到三种共同利用的代谢物（脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸，图5C）是粘着发酵中使用的氨基酸，粘着发酵是艰难梭菌和许多其他梭菌的主要能量产生过程。最近的研究表明，在非粘性发酵剂Clostridium bifermentans抑制艰难梭菌丰度并防止无菌小鼠的死亡率。研究表明，引入Stickland代谢物竞争是体内艰难梭菌抑制的相关机制。我们的数据表明，将肠道细菌C. hiranonis引入一个群落可能会加剧对所利用氨基酸的竞争。另外，数据还表明，除资源竞争外，C. hiranonis还具有一种未知的艰难梭菌抑制机制。额外的机制不是由于pH变化，也不涉及细胞外蛋白(图5E)。因此，我们推测这种抑制可能是由于由C. hiranonis产生的一种非蛋白抗生素，类似于C. cindens和梭状芽胞杆菌产生的色氨酸衍生抗生素。

       结果表明，将外部pH值降低到6.2以下的群落以pH依赖性方式抑制艰难梭菌，这与表明艰难梭菌在酸性环境中具有较低活力和孢子形成率的研究一致。我们注意到体外系统与人类肠道不同，宿主肠道上皮细胞缺乏碳酸氢盐的pH缓冲分泌。然而，我们培养基中碳酸氢盐缓冲液的量（4.8 mM）在胃肠道中的估计范围内（2-20 mM）。此外，我们观察到的pH值变化体外测量值在结肠中观察到的变化范围内，已显示其在pH 5和pH 8之间波动。这表明在我们的实验中观察到的pH变化可能与生理相关。我们还注意到一项有趣的研究，该研究发现碱性粪便pH值与CDI之间存在很强的关联。虽然不知道碱性pH是否是CDI后果的原因，但这项研究和我们的数据表明，基于pH的结肠艰难梭菌抑制策略值得进一步研究。如果降低的pH值可以抑制艰难梭菌在结肠中，控制肠道环境的pH值是抑制艰难梭菌的潜在微生物组干预策略。pH值可以通过含有强发酵剂或增加发酵的饮食底物的细菌疗法来控制。

       虽然已证明繁殖压力决定微生物入侵的成功，但我们证明这适用于合成肠道菌群中的艰难梭菌。已知繁殖压力对小鼠艰难梭菌感染很重要，小鼠与粪便中含有108 CFU/g艰难梭菌的脱落菌共存时艰难梭菌被定殖，而与粪便中含有102 CFU/g艰难梭菌的脱落菌共存时，艰难梭菌没有被定殖。然而，艰难梭菌剂量与人类CDI发病率之间的关系尚不清楚。我们的结果表明，艰难梭菌的密度可能是临床环境中艰难梭菌入侵结果的重要变量。虽然我们的数据表明艰难梭菌丰度随繁殖体压力的变化可导致长期历史依赖性（图 EV3A），但由于缺乏多重稳定性，繁殖体压力的影响在模型中是短暂的（图 EV3B）。我们的模型不受长期多物种群落测量的影响，因此可能无法准确捕捉系统的长期动态。未来的工作将使用传代或连续培养来确定繁殖体压力对艰难梭菌丰度的长期影响，并开发可以准确预测这些历史相关行为的计算模型。

       我们的绝对丰度方法结合了OD600测量和16S rRNA基因测序，以确定多物种群落中每个物种的绝对丰度。基因组提取效率、16S rRNA基因拷贝数和PCR扩增方面的偏差会影响基于16S rRNA基因测序的结果。我们通过基于OD600测量值测量含有10%艰难梭菌的混合培养物的相对丰度来测试我们工作流程中的潜在偏差（附图S7）。这些结果表明我们的方法对这些群落没有明显的偏见。之前使用这种绝对丰度方法的结果发现，75%的相互作用与无菌上清液实验定性一致。此外，我们在整个模型中推断的85%的种间相互作用与先前研究该群落的12成员子集的研究（附图S8）定性一致。总之，这些结果表明我们的绝对丰度方法在多项研究中是可重复的，并且可以破译具有生物学意义的种间相互作用，尽管存在潜在的偏差。

       综上所述，我们利用合成的肠道微生物组确定了抗艰难梭菌入侵的生态和分子机制。虽然我们的系统缺乏人类肠道微生物群的完全多样性和宿主相互作用成分，但我们的许多结果支持基于广泛系统的入侵理论原则，表明这些原则中的一些可以推广到哺乳动物的肠道环境。未来的工作可以创建具有不同权重的肠道微生物群落。这些可以在体外测试其对艰难梭菌生长的抑制作用，有希望的候选人可以被引入无菌小鼠模型，以评估其作为细菌疗法的艰难梭菌抑制潜力。

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