亚洲人非洲和欧洲裔美国人口腔微生物组以及胃癌风险的前瞻性研究

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

人类口腔中特定细菌的定植与胃癌风险有关，但既往研究受到回顾性研究设计和低分类分辨率的限制。我们进行了一项嵌套在3个队列中的前瞻性病例对照研究，以调查口腔微生物组（oral microbiome）与胃癌风险之间的关系。应用鸟枪法宏基因组测序（Shotgun metagenomic sequencing）来表征来自165个病例和323个匹配对照诊断前口腔样本中的微生物组。通过条件逻辑回归（conditional logistic regression）评估微生物总体丰富度和微生物分类群丰度、基因家族和代谢途径与胃癌风险的关联。在每个队列中进行分析，并通过meta分析合并结果。我们发现微生物总体丰富度与胃癌风险降低相关，辛普森指数倒数（Simpson's reciprocal indexes）每标准差 (standard deviation，SD) 增加的比值比(odds ratio，OR) 为0.77（95%置信区间[CI] = 0.61-0.99）。9个分类群、38个基因家族和6条通路也显示出与胃癌风险的相关性（P < 0.05）。在病例组中，黏液奈瑟菌Neisseria mucosa和Prevotella pleuritidis富集，而口腔支原体Mycoplasma orale和尤氏真杆菌Eubacterium yurii减少，对应的中心对数比率（Centered log-ratio，clr）转换的分类群丰度每SD增加的ORs和95% CI分别为 1.31 (1.03-1.67), 1.26 (1.00-1.57)、0.74 (0.59-0.94) 和 0.80 (0.65-0.98)。与胃癌风险相关的前两个基因家族（P = 3.75 × 10 -4和3.91 × 10 -4）和通路（P = 1.75 × 10 -3和1.53 × 10 -3）与风险降低有关，并参与己糖醇代谢（hexitol metabolism）。我们的研究支持口腔微生物群可能在胃癌病因学中发挥作用的假设。    

论文ID

原名：Prospective study of oral microbiome and gastric cancer risk among Asian, African American and European American populations 

译名：亚洲人、非洲裔美国人和欧洲裔美国人口腔微生物组以及胃癌风险的前瞻性研究

期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER

IF：7.396

发表时间：2021.10.18

通讯作者：Xiao-Ou Shu 

通讯作者单位：美国范德比尔特大学医学中心，范德比尔特-英格拉姆癌症中心（Vanderbilt-Ingram Cancer Center），范德比尔特流行病学中心

DOI号：10.1002/ijc.33847

实验设计

结果

1. 研究参与者的特征

研究参与者的人口学特征见表1。在488名参与者中，107例病例和212例对照（其中105组每组1个病例有2个对照，另2组每组1病例有1个对照）来自上海女性健康研究和上海男性健康研究（Shanghai Women's Health Study and Shanghai Men's Health Study，SWMHS），58个病例和111个对照（其中有53组每个病例匹配两个对照，另有5组每个病例匹配1个对照）来自南部社区队列研究（Southern Community Cohort Study，SCCS）。总体而言，本研究中参与者的教育和收入水平相对较低，仅约15%的参与者高中毕业，约10%的参与者收入高于中等水平。病例组和对照组在所有相匹配的变量上都具有可比性，包括入学年龄、性别、种族 (SCCS) 和吸烟状况。对于不匹配的变量，与对照组相比，病例组具有更高的2型糖尿病（T2D）患病率，且在既往吸烟的病例中吸烟包年量也更高，尽管二者都没有统计学差异。在亚洲人和非洲裔美国人（African Americans，AAs）中，病例组的既往饮酒者比例较高；而在欧洲裔美国人（European Americans，EAs）中，病例组中既往饮酒者比例较低。与亚洲人相比，AAs和EAs更有可能是既往吸烟者（40.7% vs 77.1% vs 64.7%）和既往饮酒者（21.3% vs 45.8% vs 43.1%），具有更高的平均BMI值（23.8 vs 30.2 vs 31.2）和更高比例的低收入状况（13.5% vs 54.2% vs 43.1%）。此外，在研究登记时，AA 和 EA 受试者的高血压（66.9% 和 56.9%）和 T2D（28.0% 和 29.4%）的患病率高于亚洲人（33.2% [高血压] 和 6.6% [T2D]）。

 表1 来自上海女性健康研究和上海男性健康研究（SWMHS）以及南部社区队列研究（SCCS）的研究参与者的特征。

a P值通过排除缺失值的双侧t检验或卡方 (χ 2 ) 检验计算。b 均值±标准差 (SD) 表示入组时的年龄、BMI、每天吸烟和饮酒的包年数。c SWMHS和SCCS参与者的人均年收入(¥) 和家庭年收入 ($) 分别列在表格上。SWMHS男性参与者、SWMHS女性参与者和SCCS参与者的中等收入分别定义为¥6000-¥10000、¥4000-¥8000和¥15000-¥50000。d 吸烟和饮酒（克/天）的包年数仅在现在和以前吸烟者以及现在和以前饮酒者中计算。

2. α和β多样性与胃癌风险的关联

一般来说，亚洲人的α多样性高于AAs和EAs，平均辛普森指数倒数分别为28.1、13.3和11.9。在亚洲人中发现α多样性与胃癌风险降低之间存在显著关联，病例组的平均辛普森指数倒数为25.5，对照组为29.5。辛普森指数倒数每1SD增加的OR为 0.68（95% CI：0.52-0.90）。在AAs或EAs中，病例组和对照组之间的辛普森指数倒数没有观察到显著差异。在meta分析中，辛普森指数倒数与胃癌风险的降低之间始终存在显著相关性（OR = 0.77；95% CI：0.61-0.99）。这种关联在从不饮酒者中更为明显，OR为0.69（95% CI：0.51-0.93）。meta分析也显示香农指数（Shannon index）与胃癌风险呈显著负相关（OR = 0.76；95% CI：0.59-0.99）。在对所有样本的联合分析中，胃癌病例和对照组之间的β多样性没有显著差异，P值分别0.76（Bray-Curtis）、0.39（wUniFrac）和0.81（uwUniFrac）。类似地，在队列的具体分析中观察到无效关联（所有P> 0.05）。

  3. 微生物分类群与胃癌风险的关联

在门水平上，与AA和EA受试者相比，亚洲参与者的变形菌门Proteobacteria（24.6% vs 12.0% vs 13.6%）和梭杆菌门Fusobacteria（6.6% vs 1.4% vs 1.4%）的平均相对丰度较高，但厚壁菌门Firmicutes水平较低（36.3% vs 50.8% vs 51.1%)。尽管SWMHS（~94%）和 SCCS（AAs为~89%，EAs为~69%）参与者的血浆/血清幽门螺杆菌（H. pylori）抗体阳性率很高，但在本研究所有参与者口腔样本中均未检测到这种细菌。我们调查了先前报道的与胃癌风险相关的6种牙周致病菌，包括牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis），齿垢密螺旋体（Treponema denticola，T. denticola），Aggregatibacter actinomycetemcomitans，中间普雷沃菌（Prevotella intermedia），福赛斯坦纳菌（Tannerella forsythia，T. forsythia）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）。尽管meta分析并未显示亚洲人中这些致病菌有相关性（所有P>0.05），但P. gingivalis被发现与胃癌风险增加有关。在亚洲人中，这种细菌clr转化的绝对丰度的OR/SD增加为1.37（95% CI：1.01-1.86），P = 0.04。 

此外，共有427种微生物分类群被纳入meta分析，其中9种被发现与胃癌风险显著相关，P< 0.05（表2和图1）。这9个分类群中有5个与胃癌风险增加有关，包括变形菌门下的四个分类群，包括变形菌纲Betaproteobacteria (纲)，奈瑟菌目Neisseriales (目), 奈瑟菌科Neisseriaceae (科) 和黏膜奈瑟菌 Neisseria mucosa (属)，以及来自拟杆菌门Bacteroidetes的一个种——Prevotella pleuritidis。黏膜奈瑟菌N. mucosa与胃癌风险增加相关，OR为1.31（95% CI：1.03-1.67），P = 0.03。这种关联可能推动了在更高分类等级的三个分类群中观察到的关联，即变形菌纲Betaproteobacteria、奈瑟菌目 Neisseriales 和奈瑟菌科Neisseriaceae，这些都与胃癌风险增加有关 (P<0.05)。值得注意的是，这种细菌与胃癌的关联在族群之间显示出一致的关联模式，并且在meta分析中具有显著性，亚洲参与者中黏膜奈瑟菌的相对丰度大约是AA和EA受试者的10倍。P.  pleuritidis的丰度在3个种族之间是类似的，并且该物种与胃癌风险的关联在种族之间显示出相同的方向，尽管只有meta分析的点估计达到了统计学差异（OR = 1.26；95% CI：1.00-1.57）。

  表2. meta分析中与胃癌风险相关的微生物分类群。

缩写： C，纲；CI，置信区间；F，科；G，属；O，目；OR，比值比；S，种。 a clr转换的分类群绝对丰度每SD增加的ORs和95% CI， P 值来自meta分析。 b 从条件logistic回归模型计算出clr转换的分类群绝对丰度每SD增加的ORs和 95% CI和P值，另外根据年龄、教育、吸烟年限、饮酒状态、高血压状态和2型糖尿病 (T2D) 状态调整。

图1 9种微生物分类群与胃癌风险间关联的森林图。通过条件logistic回归进行估计clr转化的类群绝对丰度每SD增加的OR和95%置信区间和P值。P，门；C，纲；F：科；G，属；O，目；S：种。  

在meta分析中其余4个分类群与胃癌风险降低相关，P<0.05，柔膜菌门Tenericutes显示出最显著的关联，OR为0.70（95%CI：0.55-0.88），P =2.98×10-3。这种关联主要归因于口腔支原体Mycoplasma orale，它与胃癌风险降低相关，OR为0.74（95% CI：0.59-0.94），P=0.01。meta分析中尤氏真杆菌Eubacterium yurii与胃癌风险降低之间的关联主要归因于亚洲人和AAs的数据。在meta分析中Cutibacterium与胃癌风险降低相关（P=0.02）。该菌属的关联模式在3个族群中是一致的；然而，OR似乎在AAs中最强。值得注意的是，AAs (69.5%) 和 EAs (70.6%) 中Cutibacterium的患病率是亚洲人 (13.5%) 的五倍以上。

按癌症诊断时间进行分层分析，除了P. pleuritidis外，其他8种分类群仅在样本收集5年以上确诊的病例中显示与胃癌风险的显著相关性。在按种族进行的分层分析中，在亚洲人、AAs和 EAs中分别有18、7和19个分类群与胃癌风险相关，P<0.05。除了表2所示的少数几种关联模式外，三个种族之间的大多数关联模式并不一致。例如，在亚洲人中柔膜菌门Tenericutes, 放线菌门Actinobacteria 和变形菌门Proteobacteria与胃癌风险显著相关，即使错误发现率(FDR) <0.05。然而，在AAs或EAs中这三个门并未显示与胃癌的显著关联（P< 0.05），并且关联方向不一致。在按性别、吸烟状况和饮酒状况分层的分析中，meta分析的9个显著关联中，很少能在所有分组中仍然保持显著性。变形菌纲Betaproteobacteria , 奈瑟菌目Neisseriales , 奈瑟菌科Neisseriaceae的关联在男性、既往吸烟者和饮酒者中显著；但黏膜奈瑟菌N. mucosa仅在男性中显著。P. pleuritidis的相关性在任何特定组中均不显著（所有P>0.05）。在从不吸烟者（P=6.06×10-3和0.04）和从不饮酒者（P=0.03和0.02）中，柔膜菌门Tenericutes和口腔支原体M. orale都与胃癌风险的显著降低相关。此外，女性与柔膜菌门Tenericutes具有显著相关性（P=7.56×10-3)，而在男性中仅观察到 口腔支原体M. orale的显著性 (P=0.04)。尤氏真杆菌E. yurii与男性（P=9.53×10-3）和从不饮酒者（P =0.03）的胃癌风险增加显著相关，而Cutibacterium仅在女性中发现（P=0.02）与胃癌风险降低显著相关。

4. 微生物基因家族和代谢途径与胃癌风险的关系

meta分析中共检测了3080个基因家族和279个代谢途径。其中有38个基因家族和6条通路与胃癌风险显著相关，P<0.05。38个基因家族中的10个（GO术语，gene ontology [GO] terms），其中ORs最高的5个和ORs最低的5个已经展示在表3、图2中。与胃癌风险降低最显著相关的前两个GO术语是GO:0009010（山梨糖醇-6-磷酸2-脱氢酶活性，sorbitol-6-phosphate 2-dehydrogenase activity）和 GO:0006062（山梨糖醇分解代谢过程，sorbitol catabolic process）。这2个GO术语的反正弦平方根（Arcsine square root，asr）转换相对丰度的每个SD增加的OR分别为为0.64（95% CI：0.50-0.82）和0.64（95% CI：0.50-0.82），P值分别为3.75×10-4和3.91×10 -4。麦芽糖磷酸化酶活性（maltose phosphorylase activity）(GO:0050082) 和含蛋白质复合物（ protein-containing complex）(GO:0043234) 是与胃癌风险增加最显著相关的前2个基因家族，OR分别为1.27（95% CI：1.02-1.58）和1.26 (95% CI: 1.03-1.55)，P值均为0.03。

  表3. meta分析中与胃癌风险相关的功能性微生物标志物。

缩写：BP，生物过程；CC，细胞成分；CI，置信区间；MF，分子功能；OR，比值比；TCA，三羧酸。a 反正弦平方根(asr)转换的功能标记物相对丰度每SD增加的OR和95% CI，P值来自于meta分析。b用条件logistic回归模型计算asr转化的功能标记物相对丰度和P值每SD增加的ORs和95% CI，另外根据年龄、教育、吸烟年数、饮酒状态、高血压状态和T2D状态调整。c 从SWMHS和SCCS的组合数据中选择与胃癌风险相关（P < 0.05）的38个基因家族。展示了十个基因家族，其中5个具有最低ORs，五个具有最高ORs。支持信息表8提供了包括所有这38个基因家族的完整列表。

  图 2  10 个选定微生物基因家族与胃癌风险之间关联的森林图。显示了 10 个基因家族， 5 个显示最大 ORs ，另外5个显示最小 ORs 。通过条件 logistic 回归估计 asr 转化的基因家族相对丰度每 SD 增加的 ORs 和 95% 置信区间和 P 值。 BP ：生化过程； CC ，细胞成分； MF ：分子功能。  

在meta分析中与胃癌风险显著相关（P<0.05）的6种代谢途径已展示在表3和图3中。与基因家族的结果一致，2种己糖醇代谢相关途径和胃癌风险降低相关，包括己糖醇降解超级途径（superpathway of hexitol degradation，HEXITOLDEGSUPER-PWY) 和己糖醇发酵成为乳酸、甲酸、乙醇和乙酸途径（hexitol fermentation to lactate, formate, ethanol and acetate pathway，P461-PWY），OR分别为0.71（95% CI：0.57-0.88）和0.69（95% CI：0.55-0.87），P值分别为 1.75 ×10-3和1.53×10-3。多胺生物合成超途径II ( superpathway of polyamine biosynthesis II ，POLYAMINSYN3-PWY) 也与胃癌风险降低相关，OR为0.80（95% CI：0.64-0.99），P=0.04。另一方面，两种类型的三羧酸 (TCA) 循环（克雷布斯循环）（ tricarboxylic acid (TCA) cycles (Krebs cycle)，II和VII与胃癌风险增加相关，OR分别为1.29（95% CI：1.04-1.59）和 1.25（95% CI: 1.01-1.54)，P值分别为0.02和0.04。

图3 6种微生物代谢途径与胃癌风险之间关联的森林图。通过条件logistic回归估计了asr 转换的通路相对丰度每SD增加的优势比和95%置信区间和P值。  

按样本收集和癌症诊断间的时间间隔分层的分析中，38个基因家族中的 12个以及6条通路中的4条显示与分层组中的胃癌显著相关，包括样本收集后5年以确诊的病例。38个基因家族中，更可能在男性（男性n=11 vs 女性n=5）、既往吸烟者（n=27 VS n= 4从不吸烟者中）和从不饮酒者（n=19 vs n=3在饮酒者中）发现显著关联（P<0.05）。6种代谢途径仅在男性（n=5 vs女性无）和既往吸烟者（n=6 vs 从不吸烟者）中发现显著关联（P< 0.05 )。按饮酒状态分层时，2种己糖醇代谢相关途径的关联仅在从不饮酒者中显著，而2个TCA循环仅在经常饮酒者中显示出显著关联。

在亚洲人、AAs和EAs中，分别发现127、71和152个基因家族与胃癌风险相关，P< 0.05。此外，在这3个种族中分别有24、2和4种代谢途径显示与胃癌风险的相关性。与微生物分类群的发现类似，除了表3和支持信息表8中显示的那些之外，在所有种族群体中很少能一致地观察到这些关联。例如，在与亚洲人胃癌显著相关的151个基因家族和通路（P<0.05) 中，仅约10% (n=15) 在AAs和EAs中显示出一致的关联方向。

讨论

在这项首个关于口腔微生物和胃癌风险的前瞻性研究中，微生物总体丰富度以及柔膜菌门Tenericutes、口腔支原体M. orale和尤氏真杆菌E. yurii和Cutibacterium丰度的降低以及变形菌纲Betaproteobacteria , 奈瑟菌目Neisseriales , 奈瑟菌科Neisseriaceae, 黏膜奈瑟菌N. mucosa和P. pleuritidis等丰度的增加与胃癌风险增加有关。此外，4种己糖醇代谢相关微生物基因家族和代谢途径丰度的降低，以及微生物TCA循环II和VII丰度的增加与胃癌风险增加有关。我们的研究结果表明，在人体口腔中，整体微生物丰富度和多种微生物可能在胃癌病因学中发挥作用。 在一项关于舌苔微生物组的研究中，健康个体的α多样性高于胃癌患者。另外两项胃活检研究表明，健康个体的胃微生物群的α多样性高于胃癌患者。此外，最近的一项研究发现，与胃癌患者的唾液样本相比，胃炎患者的唾液样本具有更高的α多样性。所有这些发现表明，人体口腔和胃组织中较高的α多样性可能会保护宿主免于发生胃肿瘤。本研究是第一个证明诊断前口腔样本的 α多样性与胃癌风险降低相关的前瞻性研究。 口腔健康不佳与胃癌风险增加有关。最近一项美国的研究比较了35名胃癌癌前病变患者和70名对照组的唾液和牙菌斑样本中牙周病原体的丰度。他们发现福赛斯坦纳菌T. forsythia，齿垢密螺旋体T. denticola和A. actinomycetemcomitans的负担与胃癌癌前病变的风险增加有关。我们发现牙龈卟啉单胞菌P. gingivalis与亚洲人患胃癌的风险增加有关。在2项EAs口腔微生物组的前瞻性研究中，这种病原体与胰腺癌和食管鳞状细胞癌的风险相关。 在本研究中，变形菌纲Betaproteobacteria， 奈瑟菌目Neisseriales, 奈瑟菌科Neisseriaceae和黏膜奈瑟菌N. mucosa与胃癌风险增加有关。在我们团队开展的一项平行病例对照研究中，使用鸟枪法宏基因组测序评估了来自89名胃癌癌前病变患者和89名匹配对照的口腔样本中的口腔微生物组，发现这四种分类群都与胃癌癌前病变风险增加相关，奈瑟菌目Neisseriales和奈瑟菌科Neisseriaceae的相关性达到统计学差异（P<0.05）。此外，在具有口腔和胃微生物组数据的97名受试者中，口腔样本中这四种分类群的丰度与胃样本中的丰度高度相关（Spearman相关系数r为 0.75-0.78，所有P< 0.01）。黏膜奈瑟菌N. mucosa是人体上呼吸道中的一种共生细菌，很少有报道称其与人类疾病有关。 在本研究中，柔膜菌门Tenericutes、口腔支原体M. orale和尤氏真杆菌E. yurii与胃癌呈负相关。柔膜菌门Tenericutes由无细胞壁的革兰氏阴性细菌组成，据先前提及的舌苔微生物组的研究报道，在健康对照组中，柔膜菌门Tenericute比胃癌患者中更丰富。 口腔支原体M. orale 是健康人类口咽部的一种共生细菌，没有研究表明它与任何人类癌症有关。关于E. yurii的信息很少。Cutibacterium acnes是Cutibacterium常见的一种物种，并且与本研究中AAs的胃癌风险降低有关。该物种主要存在于健康个体的皮肤微生物群中。这些细菌在口腔中的作用及其与胃癌的关系尚不清楚。在我们团队进行的一项平行病例对照研究的胃组织中也检测到了柔膜菌门Tenericutes、口腔支原体M. orale和尤氏真杆菌E. yurii，发现胃样本中这些细菌的丰度和口腔样本中的丰度相关（Spearman相关r为0.56-0.60, 所有P<0.01) 。 在本研究中和胃癌风险降低相关的GO:0006062、GO:0009010、HEXITOLDEGSUPER-PWY和P461-PWY均与己糖醇代谢有关。此外，在上述提及的我们团队的平行病例对照研究中，除HEXITOLDEGSUPER-PWY之外的所有药物一致与癌前病变风险降低相关，P<0.05。通常，己糖醇通过 HEXITOLDEGSUPER-PWY降解并通过P461-PWY发酵成乳酸、甲酸、乙醇和乙酸。山梨糖醇分解代谢生物过程（GO:0006062）属于己糖醇分解代谢的生物过程。山梨糖醇-6-磷酸 2-乳酸脱氢酶(GO:0009010) 的活性属于氧化还原酶家族，包含在P461-PWY中。龋齿需要牙菌斑中的微生物将糖发酵成酸，而己糖醇用作糖替代品可防止龋齿的形成。胃癌与己糖醇代谢中的多种代谢标志物呈负相关，结合先前的牙周病与胃癌之间联系的报道，这提示己糖醇可能参与胃癌的发病。 本研究的主要局限性是种族或性别特定分析的样本量有限，尽管我们的研究是迄今为止关于这一话题的最大研究。另一方面，仅收集了研究参与者一次口腔样本，难以评估口腔微生物群的动态变化及其与胃癌发展的关系。此外，口腔样本是在胃癌诊断10年前收集的，让人担忧口腔微生物组可能会随着时间的推移而发生变化。但之前的研究表明，口腔微生物组在很长一段时间内都非常稳定。此外，根据样本收集到癌症诊断的时间间隔≤5年vs>5年进行的分层的补充分析结果显示了类似的关联模式。此外，不同的实验方法，即SWMHS中采用刷牙加漱口，SCCS中采用漱口来收集口腔样本，这可能会引入差异并降低找到更一致关联的机会。 我们的研究有以下几点优势。首先，我们的研究是口腔微生物组与胃癌风险的第一个前瞻性研究。我们的时滞相关分析表明我们的大多数发现不太可能归因于反向因果关系。此外，本研究采用鸟枪法宏基因组测序，这不仅提高了物种水平微生物谱的分辨率，而且可以直接评估功能性微生物标志物与胃癌风险的关联。此外，我们的研究是第一项基于人群的研究，涉及胃癌高危人群（亚洲人，AAs）和尚待研究的人群（AAs）。最后，整个分析过程中，胃癌的各种确定的和/或可能的危险因素，包括吸烟和饮酒量、教育水平、BMI、饮食质量、高血压和T2D都进行了调整，从而减少研究结果被这些因素影响的可能性。 总之，我们的前瞻性宏基因组学研究表明，总体微生物丰富度、9个微生物分类群、38个微生物基因家族和6条微生物代谢途径与胃癌风险相关。我们的研究结果为口腔微生物组可能在胃癌的病因学中发挥作用的假设提供了证据。未来需要进行更大规模的研究来验证我们的发现。

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